NR2B、 p ERK、 p Elk21 共同参与大鼠逃避性学习和记忆
摘要 目的: 探讨 NR2B2p ERK 2p Elk21 途径是否参与了大鼠各学习记忆相关脑区 Y 2迷宫逃避性学习和记忆。方
法: 健康雄性成年 SD 大鼠 45 只 ,共分为 4 组: ①ifenprodil 腹腔注射组(ifenprodil ip ,14 只) , ②DMSO 腹腔注射组
(DMSO ip ,15只) ; ③ ifenprodil脑室注射组(ifenprodil ic ,8只) ; ④ DMSO脑室注射组(DMSO ic ,8 只) 。以 Y迷宫训
练和测试成绩作为行为学评定指标 ,用**组织化学和 Western blot 方法观察大鼠学习记忆相关脑区p ERK1/ 2 和
p Elk21 的变化。结果: Ifenprodil ip 组与 DMSO ip 组动物的 Y迷宫学习成绩没有明显差异( P > 0. 05) ,但 ifenprodil
ip 组 Y迷宫记忆成绩差于 DMSO ip 组( P < 0. 05) 。腹腔注射 ifenprodil 导致 Y迷宫训练后各脑区 p ERK1/ 2 和
p Elk 21 表达的普遍下降 ,其中以海马、边缘区、杏仁核*为明显 ,与 DMSO ip 组相比差异有显著性( P < 0. 05) 。
Ifenprodil ic组与 DMSO ic组**次 Y迷宫测试成绩没有明显差异( P > 0. 05) 。**次测试后立即脑室给药并在
给药后 6 h测试 Y迷宫记忆再巩固成绩 ,发现ifenprodil ic组成绩下降 ,与 DMSO ic组相比有明显差异( P < 0. 05) ,
而且ifenprodil ic组动物各脑区的p ERK1/ 2和p Elk21 表达与 DMSO ic组相比均普遍下降 ,其中p Elk21 表达在尾壳
核和边缘区几乎完全消失。结论: NR2B对于大鼠 Y迷宫长期记忆的形成、记忆再巩固过程是必要的 ,NR2B 的失
活将破坏这些过程。同时 NR2B的失活减弱了 Y迷宫训练后及记忆再巩固测试后学习记忆相关脑区p Elk21 和
p ERK1/ 2表达 ,其中在尾壳核和边缘区 ,NR2B的失活使记忆再巩固测试后p Elk21 表达完全被阻断。
关键词: NR2B ; p ERK; p Elk21 ; 学习和记忆; 信号转导; 大鼠
在神经元中 ,胞外信号反应激酶(ext racellular
response kinase ,ERK)途径在调节细胞存活和神经
元可塑性中起重要作用。ERK下游靶目标包括突
触可塑性所必需的转录因子 CREB ,Elk21 等。神经
元中 ERK活性被多条胞外信号途径的信号分子所
调节。NMDA 依赖的 ERK蛋白激酶的激活需要包
含有 NR2B 亚基的受体通道的开放和 Ca
2 +
的进入。
Ifenprodil 作为一种 NMDA 受体拮抗剂 ,可以
非典型性非竞争性地选择性结合于NR2B 亚单位的
谷氨酸结合位点 ,从而选择性地阻断含有 NR2B 亚
基的 NMDA 受体的作用。NR2B 亚基特异的 NM2
DA受体抑制剂 ifenprodil 以 3μmol/ L 的浓度即可
抑制培养的海马神经元中 60 %的 NMDAR电流 ,同
时也使 70 % NMDAR 依赖的 ERK 的激活受到抑
制[1 ]
。本实验即是通过对大鼠训练前腹腔注射
ifenprodil 和记忆测试后脑室注射 ifenprodil 来观察
Y迷宫学习记忆行为的变化并用**组织化学和
Western blot 方法观察ifenprodil 对 Y迷宫训练后大
鼠各学习记忆相关脑区p ERK1/ 2 和p Elk21 表达 的
影响 ,以探讨 NR2B、 p ERK1/ 2、 p Elk21 信号通路是
否参与了 Y迷宫行为模式的学习记忆及记忆的再巩固。
1 材料与方法
1. 1 动物
健康雄性成年 SD大鼠 45 只 ,购自**军医大
学实验动物中心。体重 200～300 g。保持光照/黑
暗12 h循环恒定 ,食物由实验中心提供 ,饮用自来
水。
1. 2 实验分组
动物共分为 4 组: ( 1) ifenprodil 腹腔注射组(ifenprodil ip ,14 只) ; (2) ,DMSO 腹腔注射组(DM2
SO ip ,15 只) ,此2 组中分别有7 只动物在训练后立
即处死 ,用来进行**组织化学染色; (3) ifenprodil
脑室注射组(ifenprodil ic ,8 只) ; (4) DMSO 脑室注
射组(DMSO ic ,8 只) ,分别在记忆测试后立即给与
脑室注射。
1. 3 手术与给药
腹腔注射动物在训练前 15 min 给药。将 ifen2
prodil 溶于二甲基亚砜(DMSO)中 ,浓度为 1. 2 mg/ml ,注射量 3 mg/ kg ;DMSO腹腔注射组注射同样体
积DMSO。
脑室注射组动物在第 2 d 记忆测试后立即经腹
腔注射 10 %水合氯醛(0. 4 ml/ 100 g) ,固定于脑立
体定位仪上 ,双侧脑室钻孔(坐标:前囟后 1. 6 mm ,
中线两侧 2. 0 mm ,深 3. 5 mm) ,将**通过玻璃电
极垂直缓慢注入 ,并留针 10 min。Ifenprodil 溶于
DMSO中 ,浓度为 2. 0μg/μl ,每侧注射 0. 5μl ;DM2
SO脑室注射组注射同样体积DMSO。
1. 4 电 Y迷宫中厌暗逃避反射训练电 Y型迷宫三条臂的尽头均有一灯 ,底部是电
网 ,实验时其中有一条臂末端的灯发出亮光 ,此时该
臂底部电网无电流通过 ,为**区;另两臂末端的灯
不亮 ,底部电网通电(约 50～70 V) ,为非**区。
**区与非**区随机改变。每当大鼠到达**区
30 s 后再随机改变**区的位置 ,转变 5 s 后非安
全区底部电网即有脉冲电流通过 ,刺激正常大鼠足
底而驱使其跑向**区。大鼠在 10 s 内从非**
区一次性跑向**区即被判为正确 ,否则均判为错
误。**天训练在每只大鼠上重复 60 次 ,记录正确
次数。少于 25 次视为不合格 ,弃去并及时补充动
物。ifenprodil ip 组及其对照 DMSO ip 组在训练前15 min腹腔注射。训练结束 24 h 后(**天)进行
Y迷宫测试 30 次 ,记录正确次数。ifenprodil ic 和
DMSO ic组在 Y迷宫测试后立即进行脑室注射 ,并
在 6 h 后测试动物 Y迷宫记忆的再巩固。
1. 5 **组织化学标本取材和染色
腹腔注射组动物进行**天测试后立即腹腔内
注射 10 %水合氯醛(4 mg/ 100 g)麻醉动物。经主
动脉 4 %多聚甲醛灌注固定。冠状冰冻切片 ,厚度
35μm。常规ABC法染色 ,一抗分别为兔抗单克隆
p ERK1/ 2 抗体(1∶ 200 , Cell Signaling Technology 公
司)和兔抗多克隆p Elk21 抗体(1∶ 100 ,Cell Signaling
Technology 公司) 。采用硫酸镍铵增强的二氨基联
苯胺( GDN)法显色。阴性对照用正常二抗同源血
清代替一抗 ,其它步骤相同。
1. 6 数据的采集
p Elk21 **阳性神经元使用 scion image 图像
分析系统 ,每只动物每个脑区选取 5 张切片 ,每张切片选择一个代表性视野在 200 倍光镜下检测平均光
密度。每只动物所选取切片层面基本相同 ,*后计
算每组大鼠每个脑区 p Elk21 **阳性神经元平均
光密度。p ERK1/ 2 **阳性细胞计数在 Olympus显微镜 100X 物镜下进行 ,每只动物所取切片层面
基本相同 ,数目相同 ,各脑区均取 5 张连续切片 ,获
得该区阳性神经元均数 ,*后计算每组大鼠每个脑
区p ERK1/ 2 **阳性神经元平均数。
1. 7 Western blot
脑室注射组记忆再巩固测试后立即断颈取脑 ,
置干冰上分离嗅球、前额叶、尾壳核、边缘区、海马、
小脑组织。低温匀浆 , 4 ℃, 10 000 ×g 离心 1 h ,
Bradford法测蛋白浓度 ,变性后 - 80 ℃保存。SDS2
PAGE电泳:8 %分离胶 ,5 %分离胶 ,电泳完毕在半
干电转仪上将蛋白转移至硝酸纤维膜上 ,常规蛋白
**印迹染色 ,一抗分别为兔抗 p ERK1/ 2 抗体(1∶
1 000 ,Cell Signaling Technology 公司)及兔抗 p Elk21 抗体(1∶ 1000 ,Cell Signaling Technology 公司) ,*
后采用硫酸镍铵增强的二氨基联苯胺( GDN)法显
色。Scion Image图象处理软件分析各泳道p ERK1/
2和蛋白条带光密度(OD)值以及各自的参照泳道
OD值。计算待检测泳道 p ERK1/ 2 和 p Elk21 泳道
与各自相应的参照泳道的 OD比值。
1. 8 统计学处理
所有数据以均数 ±标准差( … x ±s)表示 ,统计分
析软件采用 SPSS13. 0 ,组间分析采用 one2way
ANOVA。2 结果
2. 1 训练前腹腔注射ifenprodil 对大鼠 Y迷宫学习
及 24 h 后 Y迷宫记忆的影响
训练前 15 min 腹腔注射 ifenprodil 组动物的 Y
迷宫学习成绩与 DMSO ip 组相比 ,没有明显差异
( P > 0. 05) ,但是在 24 h 后测试动物的 Y迷宫记
忆 ,ifenprodil ip 组成绩差于 DMSO ip 组成绩( P <
0. 05 ,表 1)
Tab. 1 Effect of ifenprodil peritoneal injection before t raining
on rat Y 2maze memory( Times , … x ±s)
Group Number
Y 2maze score
Training Test
Ifenprodil ip 7 35. 42 ±5. 74 17. 71 ±2. 69 3
DMSO ip 8 35. 00 ±3. 66 21. 75 ±3. 692.2 训练前腹腔注射ifenprodil 对各学习记忆相关脑
区pERK1/ 2和pElk 21表达的影响
Y迷宫训练后立即取标本检测两组大鼠pERK1/ 2
和pElk 21在各脑区的表达差异,发现ifenprodil ip 组各
