pERK1 /2在大鼠脑内的分布及Y迷宫
【摘要】目的明确pERK1 /2在大鼠脑内的分布及Y迷宫训练后的时程变化。方法55只健康成
年SD大鼠,分为正常对照组, Y迷宫训练组,假训练组,其中训练组与假训练组再各分为训练后0h、1h、3h、
6h、24h亚组,每组动物各5只。训练组动物接受Y2迷宫光电结合训练,假训练组动物接受光电不结合假
训练,应用**组织化学方法检测各组大鼠脑内各区pERK1 /2阳性神经元分布及表达的变化。结果正
常对照组pERK1 /2**阳性神经元分布较少,但在双侧视上核、室旁核表达很丰富,其次在小脑分子层和
浦肯野细胞层、杏仁核、纹状皮层表达较多,海马部位偶见2～5个阳性神经元,有较多阳性纤维着色,在纹
状体整个区域无阳性神经元表达。在训练后0 h纹状体尾壳核和边缘区[ (31. 2 ±4. 8)个]出现表达,在海
马CA2、CA3区出现较多阳性神经元胞体[ (44. 2 ±4. 2)个] ,皮层大部、杏仁核的表达也有明显增强,而训
练后1h、3h、6h上述各区仍有持续增强,训练后24 h表达降至正常,纹状体边缘区阳性神经元消失,海马部
位仅有个别阳性神经元[ (3. 8 ±3. 3)个] , P值均小于0. 01。假训练组各时间点在海马、纹状体尾壳核、边
缘区等部位均无或仅有个别阳性细胞或阳性纤维,与训练组相比差异显著。结论正常状态下pERK1 /2
在全脑分布较为局限,且表达强度较低。Y迷宫学习可诱导海马、尾壳核、纹状体边缘区等区域的pERK1 /2
的表达,而且pERK1 /2参与了Y迷宫的习得、短期记忆的形成、短期记忆向长期记忆的转换和长期记忆的
形成等学习记忆的各个阶段。
【关键词】学习记忆; pERK1 /2; 大鼠; 脑
MAPK/ERK途径是一条进化保守的信号转导途
径,参与多种生理应答,包括细胞增殖,细胞存活、分
化,在神经元细胞中,参与突触可塑性[ 123 ] 。ERK接受
上游分子MAPKK (MAPK Kinase,MAPK 激酶, 又称MEK2 /MEK1)的磷酸化调控信号后, 相邻的酪氨酸和
苏氨酸均被磷酸化,从而成为活化形式的pERK 。被
激活的pERK使胞浆中其他一些酶磷酸化而直接发挥
生物学效应; 或者转移至细胞核内, 使一些转录因子
磷酸化从而调节细胞内的基因表达。越来越多的证据
表明该途径参与认知功能,如学习与记忆形成[ 427 ] 。本研究使用电Y迷宫大鼠主动逃避学习模式探讨大鼠
pERK1 /2在在全脑内的分布和训练后不同时间段
pERK1 /2表达的变化。
材料与方法
一、实验动物与分组
雄性Sp rague2Dawley大鼠55只(**军医大学实
验动物中心提供) ,体质量200～250 g,保持光照/黑暗
12h循环恒定,食物由实验中心提供,饮用自来水。动
物随机分为以下3组: 1) Y迷宫训练组; 2)假训练组;
3)正常对照组。训练组与假训练组再各分为训练后
0 h、1 h、3 h、6 h、24 h亚组,每亚组动物各5只。
二、Y迷宫训练
各组动物在Y型迷宫中适应3 d后开始训练。训
练组光电结合:电Y型迷宫3条臂的尽头均有一灯,
底部是电网,实验时其中有一条臂末端的灯发出亮光,
此时该臂底部电网无电流通过,为**臂;另两臂末端
的灯不亮,底部电网通电(约50～70V) ,为非**区
臂。**臂与非**臂随机改变。每当大鼠到达**
臂30 s后再随机改变**臂的位置,转变5 s后非**
臂底部电网即有脉冲电流通过,刺激正常大鼠足底而
驱使其跑向**臂。大鼠在10 s内从非**臂一次性
跑向**臂即被判为正确,否则均判为错误。每次训
练在每只大鼠上重复60次,记录正确次数,少于25次
被视为不合格,从训练组中去除,并随时补充动物,保
证每组只数不变。假训练组光电不结合:给光与给电
之间无固定关系,每次**臂与给光臂各自随机出现,
也以大鼠跑进**臂并达30 s为一次训练,同样连续
训练60次。正常对照组动物不接受任何训练。
三、标本取材
上述各组动物进行实验后规定时间内腹腔内注射
10%水合氯醛(4mg/100 g) 麻醉动物。开胸后剪开右
心耳,从左心室插管至主动脉,先用150ml生理盐水
(室温) 快速灌注,随后用含4%多聚甲醛的0. 1M磷
酸钠盐缓冲液500ml ( 4 ℃) 灌注固定2 h。把脑取出
后放入含30%蔗糖的0. 1M磷酸钠盐缓冲液中,并置
于4 ℃冰箱内直到沉底。冠状冰冻切片,厚度35μm。
切片依次分成2套,一套做pERK1 /2**组化,另一
套为**组化对照。
四、染色方法
切片先经0. 01mol/L 的PBS缓冲液( pH = 7. 4)
漂洗10min ×3 次,再置于预孵液(含3 g/L Triton X2
100、2 g/L 正常山羊血清、1 g/L 牛血清白蛋白、1 g/L
叠氮钠) 中预孵1 h后,加兔抗单克隆pERK1 /2抗体
(1: 200, Cell Signaling Technology 公司) , 在湿盒中
4 ℃孵育40 h。再加入羊抗兔IgG ( 1 ∶200, Vector 公
司) ,室温下置于摇床中孵育2 h,卵白素2生物素复合
物(1∶100, Vector公司) 中,室温下置于摇床中孵育色。上述各步骤之间都经0. 1mol/L PBS 液漂洗
15min ×3次。*后切片经常规脱水、透明、封片。阴
性对照用正常二抗同源血清代替一抗,其他步骤相同。
五、阳性细胞计数及统计分析
在Olympus显微镜下分别对训练组、假训练组及
对照组动物各学习记忆相关脑区的pERK1 /2**阳
性细胞进行计数。每只动物,各脑区均取5张连续切
片,获得该区阳性神经元均数,*后计算每组大鼠每个
脑区pERK1 /2**阳性神经元平均数,均数采用x ±s
表示。统计分析采用SPSS13. 0软件,组间分析采用
one2way ANOVA检验。
结果
一、正常对照组pERK1 /2**阳性神经元在全脑
内的分布
正常组pERK1 /2**阳性神经元在全脑内分布
较少,但在双侧下丘脑视上核、下丘脑室旁核表达很丰
富,其次在小脑分子层和浦肯野细胞层、杏仁核、部分
皮层表达较多,海马部位偶见2～5个阳性神经元,但
有较多阳性纤维着色;在前额叶、尾壳核、边缘区、苍白
球、脑干各核团内及其他脑区仅有微弱或无表达。
二、训练后不同时间点pERK1 /2**阳性神经元
表达情况的比较
训练后各时间点表达分布与正常对照组相比出现
差异,一些脑区表达强度出现增强。其中在正常组没
有表达的纹状体尾壳核和边缘区在训练后0 h出现表
达,在海马CA2、CA3区则出现较多阳性神经元胞体,
皮层大部、杏仁核、丘脑室旁核、小脑浦肯野细胞、下丘
脑视上核、下丘脑室旁核、室周核、部位的表达有明显
增强,而训练后1 h、3 h、6 h上述各区仍有持续增强,训
练后24 h表达降至正常,纹状体边缘区和海马阳性神
经元消失,海马部位仅有个别阳性神经元。假训练后
不同脑区表达增强情况不尽相同。在训练后0 h、1 h、3
h、6 h皮层大部、杏仁核、嗅内皮层、下丘脑视上核、下
丘脑室旁核、室周核表达有明显增强,假训练后24 h
降至正常。但假训练组在海马仅见少量阳性细胞,在
纹状体尾壳核、边缘区部位无或仅有个别阳性细胞。
见表1。
表1 pERK1 /2**阳性神经元数量在训练后各时间点
表达的变化(个, x ±s , n = 5)
组别边缘区杏仁核海马皮层
正常组- - 9. 4 ±4. 3 3. 4 ±1. 5 7. 2 ±1. 9
训练后0 h 31. 2 ±4. 8
3
65. 2 ±11. 3
3
44. 2 ±4. 2
3
73. 6 ±6. 3
3
训练后1 h 32. 0 ±5. 4
3
63. 6 ±5. 7
3
39. 8 ±4. 1
3
48. 4 ±4. 3
3
训练后3 h 32. 8 ±5. 6
3
54. 2 ±8. 6
3
33. 0 ±4. 5
3
31. 0 ±4. 1
3
训练后6 h 27. 0 ±5. 5
3
39. 8 ±8. 1
3
23. 8 ±4. 8
3
28. 2 ±2. 9
3
训练后24 h - - 9. 6 ±5. 1 3. 8 ±3. 3 8. 8 ±2. 8
注:与正常组相比3
P < 0. 01
2 h。
讨论
纹状体边缘区(marginal division, MrD)是舒斯云
首先于1987年在大鼠脑纹状体发现的一个新亚区,其
位于纹状体的尾侧,环绕苍白球的头外侧,由紧密排列
的梭形细胞构成。动物实验和人活体功能核磁共振已
初步证明MrD 与脑的学习记忆功能密切相关[ 7210 ] 。
本实验中发现虽然在正常情况下边缘区没有pERK1 /2
表达,但在Y迷宫训练后有明显表达,是学习记忆依赖的,表
明在边缘区中也存在pERK1/2激活相关的信号转导通路。
本实验中以Y2迷宫训练作为主动逃避性学习的
模型,分别在训练后0 h、1 h、3 h、6 h、24 h用**组织
化学方法检测pERK1 /2在脑内的分布和表达强度,以观察该蛋白在大鼠学习记忆相关脑区Y2迷宫行为的
习得、习得向短期记忆的转变、短期记忆、短期记忆向
长期记忆的转变以及长期记忆已经形成后的活化强度
和分布。结果发现,在正常状态下,双侧下丘脑视上核
表达就极为丰富,下丘脑室旁核表达也很丰富,其原因
尚不清楚。由于pERK1 /2参与了细胞多种生理活动,
即使没有较强的学习记忆等刺激,也可能在脑内不同
脑区表达,因此,我们的实验中发现正常组小脑分子层
和浦肯野细胞层、杏仁核、纹状皮层有少量阳性神经元
表达pERK1 /2,表明这些部位在正常状态下就有ERK
的激活。假训练组大鼠皮层大部、杏仁核、嗅内皮层在
训练后0 h、1 h、3 h、6 h都有表达增强则表明训练环境
中各种刺激如电击、灯光、外界环境的变化等都可引起相
应核团pERK1/2的升高,但是这种升高并不是学习记忆特
异的,而是这些刺激本身的物理性而导致的。
在海马、尾壳核、边缘区等与Y迷宫学习紧密相
关的几个脑区正常状态及假训练时均没有明显的
ERK的激活。海马部位仅偶见2～5个阳性神经元。
但是在训练后0 h、1 h、3 h、6 h,海马CA2、CA3区、纹状
体边缘区、尾壳核等学习记忆相关脑区表达明显增强,
表明在这些区域pERK1 /2的表达是学习依赖的,而且
参与了Y2迷宫学习记忆的习得、短期记忆的形成、短
期记忆向长期记忆的转换、长期记忆的形成等各个阶
段。训练后24h pERK1 /2表达降至正常水平,上述各
相关脑区表达再次变得微弱或没有。训练组在训练后
各个时间点同样也有皮层大部、杏仁核、嗅内皮层等区
域pERK1 /2 表达的增强,其原因可能与假训练组一
样,是环境中物理性因素造成的。Walz等[ 11, 12 ]在之前
的研究也已经证明了大鼠跳台抑制性逃避任务的长期
保持可被海马、杏仁体、内嗅皮层、顶叶皮层后部注射
MAPK抑制剂PD098059 而导致时间依赖性的破坏。
他们将MEK抑制剂PD098059注入上述部位,观察它
们对大鼠抑制性逃避的短期、长期保持的影响。发现
在训练后0min 海马注射破坏了STM, 在训练后
180min海马内注射破坏长期记忆,训练后0min内嗅
皮层注射破坏短期记忆, 180min破坏长期记忆,顶叶
皮层在训练后0min注射,杏仁核在训练后180min注射破坏了记忆保持。这些发现表明MAPK途径时间
依赖地参与抑制性回避训练后的记忆处理,时间依赖
性在各脑区是不同的。在本实验中虽然没有使用
pERK1 /2的特异性抑制剂来观察大鼠Y2迷宫行为的
变化,但从另一方面给出了pERK1 /2在该行为模式学
习记忆各个阶段的变化趋势,为进一步应用抑制剂研
究其在各脑区各时间点的功能提供了基础依据。换句
话说,也给Walz等[ 11, 12 ]的研究一定意义上提供了一
些补充。但pERK1/2在该行为模式各阶段学习记忆中的
作用和其在相关信号转导通路中的地位值得进一步研究。
