褪黑素对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
摘要: 目的 研究褪黑素(melatonin ,MT)对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法 用沙土鼠双侧颈
总动脉结扎法建立全脑缺血再灌注损伤模型。用开场迷宫测试沙土鼠的定向运动活性的变化。用 T迷宫测试沙土
鼠的学习及工作记忆能力。光镜下观察缺血后 d 7海马 CA1 区神经元组织形态学变化。结果 缺血模型组沙土鼠
定向运动活性较假手术组显著增高 ,学习及工作记忆能力降低。MT可降低沙土鼠的定向运动活性 ,提高沙土鼠的工
作记忆能力;还可显著减轻海马 CA1区锥体神经元的病理改变 ,且作用呈剂量依赖性。结论 MT对沙土鼠全脑缺
血再灌注损伤有保护作用。
关键词: 褪黑素; 脑缺血再灌注损伤; 定向运动活性; 工作记忆; 海马 CA1区
脑缺血是临床常见且预后较差的一种**。在
脑缺血的发病机制中 ,氧自由基引起的氧化损伤发
挥重要作用 ,抗氧化剂在脑缺血的**中有重要意
义。褪黑素(melatonin ,MT)是由松果体分泌的一种
神经***** ,其生理功能主要为调节体内的生
物节律、调节神经***2**系统、镇痛及**催
眠等。近几年 ,随着对MT研究的深入 ,发现其有很
强的自由基**作用及抗氧化作用[1 ,2 ]
,且易通过血
脑屏障和细胞膜[3 ]
。因此 ,MT在脑缺血性损伤中的
作用受到广泛关注。虽然MT对神经保护作用已有
报道[4 ,5 ]
,但有关MT对脑缺血后神经功能影响的研
究还很少。本工作着重从行为学和组织病理学相结
合的角度探讨MT对沙土鼠全脑缺血再灌注损伤的
影响。材 料 与 方 法
药品 褪黑素 ,Sigma 公司 ,用前溶于 5 %乙醇
生理盐水。
实验动物 蒙古种沙土鼠 , ♀♂兼用 ,3 月龄 ,
体重 50～70 g ,由徐州医学院实验动物中心提供。
自由摄食水 ,每日8∶ 00～20∶ 00给予光照。脑缺血动物模型的制备 用沙土鼠双侧颈总动
脉阻断法制备全脑缺血再灌注损伤模型[6 ]
。沙土鼠
用****钠(45 mg· kg
- 1
,ip)麻醉后 ,作颈部正中
切口 ,分离两侧颈总动脉 ,用微动脉夹夹闭。以脑电
图变为基线为缺血模型成功的标志。缺血 10 min
后松开微动脉夹 ,恢复血液灌流。在实验过程中 ,用
100瓦头灯将动物肛温控制在(3715 ±015) ℃,直至
动物苏醒。
动物分组及给药 将 55 只沙土鼠随机分成以
下5组( n = 11) : ①假手术(sham)组:手术操作同其
他组 ,但不夹闭双侧颈总动脉; ②溶剂(vehicle)组:
于缺血前 30 min ip 5 %乙醇生理盐水 ,夹闭双侧颈
总动脉10 min 后复灌; ③MT 5 mg· kg
- 1
(MT5)组;④MT 10 mg· kg
- 1
(MT10) 组; ⑤MT 20 mg· kg
- 1
(MT20)组。MT现用现配 ,配时先溶解于无水乙醇 ,
再加生理盐水稀释 ,使乙醇终浓度为 5 %。③～ ⑤
组于缺血前30 min ip MT ,处理过程同vehicle 组。
开场迷宫测试 于术后 d 3和 d 7参照文献[7 ,8 ]
方法进行开场迷宫(open field)测试 ,以评价动物的
定向运动活性P 习惯化。实验在安静、光线较暗的房
间内进行。开场迷宫为 72 cm×76 cm×57 cm的木
箱 ,木箱底部漆成网格状 ,均分为25个小格 ,每个小
格约为15 cm×15 cm。将沙土鼠放入迷宫中央 ,记
录15 min内沙土鼠在迷宫中爬行所经过的格子数 ,
以检测动物的定向运动P 探究活性 ,评价动物的习惯
化。
T迷宫测试 于术后 d 4 ,d 5 和 d 6 参照文献[9 ,10 ]方法进行 T迷宫(T 2maze)测试。T迷宫外观
呈 “T”形 ,由一个主干和两个选择臂构成 ,主干长为
60 cm ,每个臂为30 cm长、 10 cm宽、 20 cm高。在两
个选择臂的末端各有1个食物杯 ,用来放食物(本实
验所用的奖励食物为向日葵籽) ,在选择臂的近端有
一可抽拉的挡板。实验在安静的房间内进行 ,环境
条件保持稳定。在测试的前1 d进行1次训练 ,24 h
后进行测试。在测试时 ,**步先将迷宫的一个臂
挡住 ,只允许动物到达 T迷宫的另一个臂 ,在此动物
得到食物;在**步 ,将 T迷宫的两臂都开放 ,但只
有原来被挡住的臂内有食物 ,沙土鼠只有选择进入
与**步方向相反的臂才能得到食物 ,记为 1 次正确 ,如沙土鼠重新进入**步实验时去过的臂记作
1 次错误。如此两步为一组 ,两步实验间隔15 s。每
只沙土鼠每天进行 10 组实验 ,记录其正确选择次
数。为增加沙土鼠寻觅食物的动力 ,在进行测试之
前将沙土鼠禁食6 h。
海马组织形态学观察 术后 d 7 行为学实验结
束后 ,动物用****钠(45 mg· kg
- 1
, ip) 麻醉 ,开
胸 ,经左心室先快速灌注生理盐水 50 mL ,随后灌注
含 4 %多聚甲醛的 011 mol· L - 1
磷酸盐缓冲液(pH
714) 50 mL (10 mL· min
- 1
×5 min) 。取出全脑浸泡
于同一溶液中进行后固定 ,脱水后用石蜡包埋 ,自前
囟后117 mm处进行切片 ,厚度5μm ,用苏木精2伊红
(H2E)染色 ,在光镜下放大 400 倍观察海马 CA1 区
锥体神经元的病理改变。可以观察到有明显的细胞
膜、细胞核和核仁者为存活神经元 ,核皱缩、核溶解
者视为坏死神经元。缺血性神经元损伤用 0～3 分
级[11 ]
:0 ,正常神经元;1 ,少数神经元死亡( < 25 %) ;
2 ,许多神经元死亡(25 %～75 %) ;3 ,大部分神经元
死亡( > 75 %) 。
统计学处理 实验数据用 € x ±s 表示 ,多个样
本均数的比较用单因素方差分析 ,两组之间的比较
用 Student2t 检验 ,神经元损伤资料用等级序值法检
验[12 ]
。P < 0105为有显著性差异。
结 果
1 MT对脑缺血再灌注沙土鼠定向运动活性的影
响
在开场迷宫中 ,vehicle 组沙土鼠在测试中经过
的格子数均较 sham组显著增高( P < 0101) 。脑缺血
后d 3 ,MT组沙土鼠所经过的格子数均低于 vehicle
组 ,其中MT10和MT20组与vehicle 组相比有显著性差异( P < 0105或 P < 0101) 。脑缺血后 d 7 ,各组沙
土鼠定向运动活性均较 d 3降低 ,但MT组沙土鼠的
定向运动活性仍显著低于 vehicle 组 ( P < 0105或
P < 0101) 。MT能够降低脑缺血沙土鼠的定向运动
活性 ,且作用呈剂量依赖性(表1) 。
Table 1 Effect of melatonin on locomotor activity in
open f ield test of ischemia2reperfusion injured
Mongolian gerbils ( n = 11 , … x ±s)
Group
DoseP
mg· kg - 1
Squares crossed
Day 3 Day 7
Sham - 265± 105 229± 52
Vehicle - 509± 144 3 3
443± 80 3 32 MT对脑缺血再灌注沙土鼠学习记忆能力的影
响
脑缺血再灌注后 d 4 ,d 5 和 d 6 ,vehicle 组沙土
鼠在 T迷宫测试中正确选择次数均较 sham组显著
降低( P < 0101) ,表明脑缺血沙土鼠的学习及工作
记忆能力显著降低。MT组沙土鼠的正确选择次数
均高于 vehicle 组 ,MT10和MT20 组与 vehicle 组之间
的差异有统计学意义( P < 0105或 P < 0101 ,表2) 。
