NR2B、 p ERK、 p Elk21 共同參與大鼠逃避性學習和記憶

摘要 　目的: 探討 NR2B2p ERK 2p Elk21 途徑是否參與了大鼠各學習記憶相關腦區 Y 2迷宮逃避性學習和記憶。方

法: 健康雄性成年 SD 大鼠 45 隻 ,共分為 4 組: ①ifenprodil 腹腔注射組(ifenprodil ip ,14 隻) , ②DMSO 腹腔注射組

(DMSO ip ,15隻) ; ③ ifenprodil腦室注射組(ifenprodil ic ,8隻) ; ④ DMSO腦室注射組(DMSO ic ,8 隻) 。以 Y迷宮訓

練和測試成績作為行為學評定指標 ,用**組織化學和 Western blot 方法觀察大鼠學習記憶相關腦區p ERK1/ 2 和

p Elk21 的變化。結果: Ifenprodil ip 組與 DMSO ip 組動物的 Y迷宮學習成績冇有明顯差異( P > 0. 05) ,但 ifenprodil

ip 組 Y迷宮記憶成績差於 DMSO ip 組( P < 0. 05) 。腹腔注射 ifenprodil 導致 Y迷宮訓練後各腦區 p ERK1/ 2 和

p Elk 21 表達的普遍下降 ,其中以海馬、邊緣區、杏仁核*為明顯 ,與 DMSO ip 組相比差異有顯著性( P < 0. 05) 。

Ifenprodil ic組與 DMSO ic組**次 Y迷宮測試成績冇有明顯差異( P > 0. 05) 。**次測試後立即腦室給藥並在

給藥後 6 h測試 Y迷宮記憶再鞏固成績 ,發現ifenprodil ic組成績下降 ,與 DMSO ic組相比有明顯差異( P < 0. 05) ,

而且ifenprodil ic組動物各腦區的p ERK1/ 2和p Elk21 表達與 DMSO ic組相比均普遍下降 ,其中p Elk21 表達在尾殼

核和邊緣區幾乎完全消失。結論: NR2B對於大鼠 Y迷宮長期記憶的形成、記憶再鞏固過程是必要的 ,NR2B 的失

活將破壞這些過程。同時 NR2B的失活減弱了 Y迷宮訓練後及記憶再鞏固測試後學習記憶相關腦區p Elk21 和

p ERK1/ 2表達 ,其中在尾殼核和邊緣區 ,NR2B的失活使記憶再鞏固測試後p Elk21 表達完全被阻斷。

關鍵詞: 　NR2B ; 　 p ERK; 　 p Elk21 ; 　學習和記憶; 　信號轉導; 　大鼠

在神經元中 ,胞外信號反應激酶(ext racellular

response kinase ,ERK)途徑在調節細胞存活和神經

元可塑性中起重要作用。ERK下遊靶目標包括突

觸可塑性所必需的轉錄因子 CREB ,Elk21 等。神經

元中 ERK活性被多條胞外信號途徑的信號分子所

調節。NMDA 依賴的 ERK蛋白激酶的激活需要包

含有 NR2B 亞基的受體通道的開放和 Ca

2 +

的進入。

Ifenprodil 作為一種 NMDA 受體拮抗劑 ,可以

非典型性非競爭性地選擇性結合於NR2B 亞單位的

穀氨酸結合位點 ,從而選擇性地阻斷含有 NR2B 亞

基的 NMDA 受體的作用。NR2B 亞基特異的 NM2

DA受體抑製劑 ifenprodil 以 3μmol/ L 的濃度即可

抑製培養的海馬神經元中 60 %的 NMDAR電流 ,同

時也使 70 % NMDAR 依賴的 ERK 的激活受到抑

製[1 ]

。本實驗即是通過對大鼠訓練前腹腔注射

ifenprodil 和記憶測試後腦室注射 ifenprodil 來觀察

Y迷宮學習記憶行為的變化並用**組織化學和

Western blot 方法觀察ifenprodil 對 Y迷宮訓練後大

鼠各學習記憶相關腦區p ERK1/ 2 和p Elk21 表達 的

影響 ,以探討 NR2B、 p ERK1/ 2、 p Elk21 信號通路是

否參與了 Y迷宮行為模式的學習記憶及記憶的再鞏固。

1 　材料與方法

1. 1 　動物

健康雄性成年 SD大鼠 45 隻 ,購自**軍醫大

學實驗動物中心。體重 200～300 g。保持光照/黑

暗12 h循環恒定 ,食物由實驗中心提供 ,飲用自來

水。

1. 2 　實驗分組

動物共分為 4 組: ( 1) ifenprodil 腹腔注射組(ifenprodil ip ,14 隻) ; (2) ,DMSO 腹腔注射組(DM2

SO ip ,15 隻) ,此2 組中分彆有7 隻動物在訓練後立

即處死 ,用來進行**組織化學染色; (3) ifenprodil

腦室注射組(ifenprodil ic ,8 隻) ; (4) DMSO 腦室注

射組(DMSO ic ,8 隻) ,分彆在記憶測試後立即給與

腦室注射。

1. 3 　手術與給藥

腹腔注射動物在訓練前 15 min 給藥。將 ifen2

prodil 溶於二甲基亞碸(DMSO)中 ,濃度為 1. 2 mg/ml ,注射量 3 mg/ kg ;DMSO腹腔注射組注射同樣體

積DMSO。

腦室注射組動物在第 2 d 記憶測試後立即經腹

腔注射 10 %水合氯醛(0. 4 ml/ 100 g) ,固定於腦立

體定位儀上 ,雙側腦室鑽孔(坐標:前囟後 1. 6 mm ,

中線兩側 2. 0 mm ,深 3. 5 mm) ,將**通過玻璃電

極垂直緩慢注入 ,並留針 10 min。Ifenprodil 溶於

DMSO中 ,濃度為 2. 0μg/μl ,每側注射 0. 5μl ;DM2

SO腦室注射組注射同樣體積DMSO。

1. 4 　電 Y迷宮中厭暗逃避反射訓練電 Y型迷宮三條臂的儘頭均有一燈 ,底部是電

網 ,實驗時其中有一條臂末端的燈發出亮光 ,此時該

臂底部電網無電流通過 ,為**區;另兩臂末端的燈

不亮 ,底部電網通電(約 50～70 V) ,為非**區。

**區與非**區隨機改變。每當大鼠到達**區

30 s 後再隨機改變**區的位置 ,轉變 5 s 後非安

全區底部電網即有脈衝電流通過 ,刺激正常大鼠足

底而驅使其跑向**區。大鼠在 10 s 內從非**

區一次性跑向**區即被判為正確 ,否則均判為錯

誤。**天訓練在每隻大鼠上重複 60 次 ,記錄正確

次數。少於 25 次視為不合格 ,棄去並及時補充動

物。ifenprodil ip 組及其對照 DMSO ip 組在訓練前15 min腹腔注射。訓練結束 24 h 後(**天)進行

Y迷宮測試 30 次 ,記錄正確次數。ifenprodil ic 和

DMSO ic組在 Y迷宮測試後立即進行腦室注射 ,並

在 6 h 後測試動物 Y迷宮記憶的再鞏固。

1. 5 　**組織化學標本取材和染色

腹腔注射組動物進行**天測試後立即腹腔內

注射 10 %水合氯醛(4 mg/ 100 g)麻醉動物。經主

動脈 4 %多聚甲醛灌注固定。冠狀冰凍切片 ,厚度

35μm。常規ABC法染色 ,一抗分彆為兔抗單克隆

p ERK1/ 2 抗體(1∶ 200 , Cell Signaling Technology 公

司)和兔抗多克隆p Elk21 抗體(1∶ 100 ,Cell Signaling

Technology 公司) 。采用硫酸鎳銨增強的二氨基聯

苯胺( GDN)法顯色。陰性對照用正常二抗同源血

清代替一抗 ,其它步驟相同。

1. 6 　數據的采集

p Elk21 **陽性神經元使用 scion image 圖像

分析係統 ,每隻動物每個腦區選取 5 張切片 ,每張切片選擇一個代表性視野在 200 倍光鏡下檢測平均光

密度。每隻動物所選取切片層麵基本相同 ,*後計

算每組大鼠每個腦區 p Elk21 **陽性神經元平均

光密度。p ERK1/ 2 **陽性細胞計數在 Olympus顯微鏡 100X 物鏡下進行 ,每隻動物所取切片層麵

基本相同 ,數目相同 ,各腦區均取 5 張連續切片 ,獲

得該區陽性神經元均數 ,*後計算每組大鼠每個腦

區p ERK1/ 2 **陽性神經元平均數。

1. 7 　Western blot

腦室注射組記憶再鞏固測試後立即斷頸取腦 ,

置乾冰上分離嗅球、前額葉、尾殼核、邊緣區、海馬、

小腦組織。低溫勻漿 , 4 ℃, 10 000 ×g 離心 1 h ,

Bradford法測蛋白濃度 ,變性後 - 80 ℃保存。SDS2

PAGE電泳:8 %分離膠 ,5 %分離膠 ,電泳完畢在半

乾電轉儀上將蛋白轉移至硝酸纖維膜上 ,常規蛋白

**印跡染色 ,一抗分彆為兔抗 p ERK1/ 2 抗體(1∶

1 000 ,Cell Signaling Technology 公司)及兔抗 p Elk21 抗體(1∶ 1000 ,Cell Signaling Technology 公司) ,*

後采用硫酸鎳銨增強的二氨基聯苯胺( GDN)法顯

色。Scion Image圖象處理軟件分析各泳道p ERK1/

2和蛋白條帶光密度(OD)值以及各自的參照泳道

OD值。計算待檢測泳道 p ERK1/ 2 和 p Elk21 泳道

與各自相應的參照泳道的 OD比值。

1. 8 　統計學處理

所有數據以均數 ±標準差( … x ±s)表示 ,統計分

析軟件采用 SPSS13. 0 ,組間分析采用 one2way

ANOVA。2 　結果

2. 1 　訓練前腹腔注射ifenprodil 對大鼠 Y迷宮學習

及 24 h 後 Y迷宮記憶的影響　　

訓練前 15 min 腹腔注射 ifenprodil 組動物的 Y

迷宮學習成績與 DMSO ip 組相比 ,冇有明顯差異

( P > 0. 05) ,但是在 24 h 後測試動物的 Y迷宮記

憶 ,ifenprodil ip 組成績差於 DMSO ip 組成績( P <

0. 05 ,表 1)

Tab. 1 　Effect of ifenprodil peritoneal injection before t raining

on rat Y 2maze memory( Times , … x ±s)

Group Number

Y 2maze score

Training Test

Ifenprodil ip 7 35. 42 ±5. 74 17. 71 ±2. 69 3

DMSO ip 8 35. 00 ±3. 66 21. 75 ±3. 692.2　 訓練前腹腔注射ifenprodil 對各學習記憶相關腦

區pERK1/ 2和pElk 21表達的影響

Y迷宮訓練後立即取標本檢測兩組大鼠pERK1/ 2

和pElk 21在各腦區的表達差異,發現ifenprodil ip 組各