褪黑素對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
摘要: 目的 研究褪黑素(melatonin ,MT)對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用。方法 用沙土鼠雙側頸
總動脈結紮法建立全腦缺血再灌注損傷模型。用開場迷宮測試沙土鼠的定向運動活性的變化。用 T迷宮測試沙土
鼠的學習及工作記憶能力。光鏡下觀察缺血後 d 7海馬 CA1 區神經元組織形態學變化。結果 缺血模型組沙土鼠
定向運動活性較假手術組顯著增高 ,學習及工作記憶能力降低。MT可降低沙土鼠的定向運動活性 ,提高沙土鼠的工
作記憶能力;還可顯著減輕海馬 CA1區錐體神經元的病理改變 ,且作用呈劑量依賴性。結論 MT對沙土鼠全腦缺
血再灌注損傷有保護作用。
關鍵詞: 褪黑素; 腦缺血再灌注損傷; 定向運動活性; 工作記憶; 海馬 CA1區
腦缺血是臨床常見且預後較差的一種**。在
腦缺血的發病機製中 ,氧自由基引起的氧化損傷發
揮重要作用 ,抗氧化劑在腦缺血的**中有重要意
義。褪黑素(melatonin ,MT)是由鬆果體分泌的一種
神經***** ,其生理功能主要為調節體內的生
物節律、調節神經***2**係統、鎮痛及**催
眠等。近幾年 ,隨著對MT研究的深入 ,發現其有很
強的自由基**作用及抗氧化作用[1 ,2 ]
,且易通過血
腦屏障和細胞膜[3 ]
。因此 ,MT在腦缺血性損傷中的
作用受到廣泛關注。雖然MT對神經保護作用已有
報道[4 ,5 ]
,但有關MT對腦缺血後神經功能影響的研
究還很少。本工作著重從行為學和組織病理學相結
合的角度探討MT對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷的
影響。材 料 與 方 法
藥品 褪黑素 ,Sigma 公司 ,用前溶於 5 %乙醇
生理鹽水。
實驗動物 蒙古種沙土鼠 , ♀♂兼用 ,3 月齡 ,
體重 50～70 g ,由徐州醫學院實驗動物中心提供。
自由攝食水 ,每日8∶ 00～20∶ 00給予光照。腦缺血動物模型的製備 用沙土鼠雙側頸總動
脈阻斷法製備全腦缺血再灌注損傷模型[6 ]
。沙土鼠
用****鈉(45 mg· kg
- 1
,ip)麻醉後 ,作頸部正中
切口 ,分離兩側頸總動脈 ,用微動脈夾夾閉。以腦電
圖變為基線為缺血模型成功的標誌。缺血 10 min
後鬆開微動脈夾 ,恢複血液灌流。在實驗過程中 ,用
100瓦頭燈將動物肛溫控製在(3715 ±015) ℃,直至
動物蘇醒。
動物分組及給藥 將 55 隻沙土鼠隨機分成以
下5組( n = 11) : ①假手術(sham)組:手術操作同其
他組 ,但不夾閉雙側頸總動脈; ②溶劑(vehicle)組:
於缺血前 30 min ip 5 %乙醇生理鹽水 ,夾閉雙側頸
總動脈10 min 後複灌; ③MT 5 mg· kg
- 1
(MT5)組;④MT 10 mg· kg
- 1
(MT10) 組; ⑤MT 20 mg· kg
- 1
(MT20)組。MT現用現配 ,配時先溶解於無水乙醇 ,
再加生理鹽水稀釋 ,使乙醇終濃度為 5 %。③～ ⑤
組於缺血前30 min ip MT ,處理過程同vehicle 組。
開場迷宮測試 於術後 d 3和 d 7參照文獻[7 ,8 ]
方法進行開場迷宮(open field)測試 ,以評價動物的
定向運動活性P 習慣化。實驗在安靜、光線較暗的房
間內進行。開場迷宮為 72 cm×76 cm×57 cm的木
箱 ,木箱底部漆成網格狀 ,均分為25個小格 ,每個小
格約為15 cm×15 cm。將沙土鼠放入迷宮中央 ,記
錄15 min內沙土鼠在迷宮中爬行所經過的格子數 ,
以檢測動物的定向運動P 探究活性 ,評價動物的習慣
化。
T迷宮測試 於術後 d 4 ,d 5 和 d 6 參照文獻[9 ,10 ]方法進行 T迷宮(T 2maze)測試。T迷宮外觀
呈 “T”形 ,由一個主乾和兩個選擇臂構成 ,主乾長為
60 cm ,每個臂為30 cm長、 10 cm寬、 20 cm高。在兩
個選擇臂的末端各有1個食物杯 ,用來放食物(本實
驗所用的獎勵食物為向日葵籽) ,在選擇臂的近端有
一可抽拉的擋板。實驗在安靜的房間內進行 ,環境
條件保持穩定。在測試的前1 d進行1次訓練 ,24 h
後進行測試。在測試時 ,**步先將迷宮的一個臂
擋住 ,隻允許動物到達 T迷宮的另一個臂 ,在此動物
得到食物;在**步 ,將 T迷宮的兩臂都開放 ,但隻
有原來被擋住的臂內有食物 ,沙土鼠隻有選擇進入
與**步方向相反的臂才能得到食物 ,記為 1 次正確 ,如沙土鼠重新進入**步實驗時去過的臂記作
1 次錯誤。如此兩步為一組 ,兩步實驗間隔15 s。每
隻沙土鼠每天進行 10 組實驗 ,記錄其正確選擇次
數。為增加沙土鼠尋覓食物的動力 ,在進行測試之
前將沙土鼠禁食6 h。
海馬組織形態學觀察 術後 d 7 行為學實驗結
束後 ,動物用****鈉(45 mg· kg
- 1
, ip) 麻醉 ,開
胸 ,經左心室先快速灌注生理鹽水 50 mL ,隨後灌注
含 4 %多聚甲醛的 011 mol· L - 1
磷酸鹽緩衝液(pH
714) 50 mL (10 mL· min
- 1
×5 min) 。取出全腦浸泡
於同一溶液中進行後固定 ,脫水後用石蠟包埋 ,自前
囟後117 mm處進行切片 ,厚度5μm ,用蘇木精2伊紅
(H2E)染色 ,在光鏡下放大 400 倍觀察海馬 CA1 區
錐體神經元的病理改變。可以觀察到有明顯的細胞
膜、細胞核和核仁者為存活神經元 ,核皺縮、核溶解
者視為壞死神經元。缺血性神經元損傷用 0～3 分
級[11 ]
:0 ,正常神經元;1 ,少數神經元死亡( < 25 %) ;
2 ,許多神經元死亡(25 %～75 %) ;3 ,大部分神經元
死亡( > 75 %) 。
統計學處理 實驗數據用 € x ±s 表示 ,多個樣
本均數的比較用單因素方差分析 ,兩組之間的比較
用 Student2t 檢驗 ,神經元損傷資料用等級序值法檢
驗[12 ]
。P < 0105為有顯著性差異。
結 果
1 MT對腦缺血再灌注沙土鼠定向運動活性的影
響
在開場迷宮中 ,vehicle 組沙土鼠在測試中經過
的格子數均較 sham組顯著增高( P < 0101) 。腦缺血
後d 3 ,MT組沙土鼠所經過的格子數均低於 vehicle
組 ,其中MT10和MT20組與vehicle 組相比有顯著性差異( P < 0105或 P < 0101) 。腦缺血後 d 7 ,各組沙
土鼠定向運動活性均較 d 3降低 ,但MT組沙土鼠的
定向運動活性仍顯著低於 vehicle 組 ( P < 0105或
P < 0101) 。MT能夠降低腦缺血沙土鼠的定向運動
活性 ,且作用呈劑量依賴性(表1) 。
Table 1 Effect of melatonin on locomotor activity in
open f ield test of ischemia2reperfusion injured
Mongolian gerbils ( n = 11 , … x ±s)
Group
DoseP
mg· kg - 1
Squares crossed
Day 3 Day 7
Sham - 265± 105 229± 52
Vehicle - 509± 144 3 3
443± 80 3 32 MT對腦缺血再灌注沙土鼠學習記憶能力的影
響
腦缺血再灌注後 d 4 ,d 5 和 d 6 ,vehicle 組沙土
鼠在 T迷宮測試中正確選擇次數均較 sham組顯著
降低( P < 0101) ,表明腦缺血沙土鼠的學習及工作
記憶能力顯著降低。MT組沙土鼠的正確選擇次數
均高於 vehicle 組 ,MT10和MT20 組與 vehicle 組之間
的差異有統計學意義( P < 0105或 P < 0101 ,表2) 。
