荷瘤小鼠抑鬱狀態的研究（懸尾）
荷瘤小鼠抑鬱狀態的研究
懸尾實驗tail-suspension test TST
摘要：目的 觀察荷瘤小鼠大腦皮層和海馬腦源性神經營養因子(BDNF)表達水平變化，初步探討荷瘤應激引起抑鬱的分子機製。方法 建立荷瘤小鼠模型；以不同荷瘤時間的懸尾實驗 （tail-suspension test，TST）的反應作為抑鬱行為學指標；采用半定量及實時定量PCR技術分彆測定荷瘤12d後小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平。結果 荷瘤組小鼠在TST中的不動時間隨腫瘤接種時間延長而逐漸增加，於荷瘤第12天顯著降低。同時，荷瘤第12天的小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平也明顯降低，氟西汀處理可增加海馬BDNF的表達。結論 荷瘤應激可通過降低海馬及大腦皮質BDNF水平誘發抑鬱絕望狀態。懸尾實驗tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑鬱狀態的研究（懸尾）
關鍵詞：荷瘤；抑鬱；腦源性神經營養因子；氟西汀懸尾實驗tail-suspension test TST
懸尾實驗tail-suspension test TST懸尾實驗tail-suspension test TST
懸尾實驗tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑鬱狀態的研究（懸尾）
荷瘤小鼠抑鬱狀態的研究（懸尾）
The study on the development of depression in H22 tumor-bearingmice懸尾實驗tail-suspension test TST
Abstract: Objective To explore the molecular mechanisms of depression development inH22 tumor-bearing mice. Methods Tail-suspension test (TST) wasobserved as the despair behavioral response in H22 tumor-bearingmice. The expression of BDNF in the cerebrum and hippocampus ofmice were determined by RT-PCR and real time quantitative RT-PCRrespectively. Results The immobility time in TST was increased asthe tumor developed, and it changed significantly at 12 days aftertumor implantation. In the mean time, the expression of BDNFdecreased significantly in H22 tumor-bearing mice. The decreasedexpression of BDNF in hippocampus could be antagonized byfluoxetine for 12 days of treatment. Conclusion Tumor burden might induce stress-relateddepressive state by down-regulating the expression ofBDNF.
Key words tumor-bearing；depression；BDNF;Fluoxetine懸尾實驗tail-suspension test TST懸尾實驗tail-suspension test TST
臨床大量研究表明腫瘤患者的抑鬱症發病率及嚴重程度遠遠高出一般人群，但缺乏關於腫瘤與抑鬱之間關係的基礎研究。關於抑鬱的發病機製說法不一，目前較公認看法認為與應激及應激性**關係密切。Sterling和Eyer於1988年提出了"非穩態（allostasis）概念，McEwen等又於1993年詳細描述了非穩態負荷(allostasis load), 即指機體偏離機體自身穩態的程度。非穩態負荷可使機體通過調整達到穩態。正是由於非穩態，自主神經係統、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸和機體各係統不僅能對內源性和外源性應激源產生積極反應以保護機體,也會因慢性過度的或消極的反應而導致機體的紊亂和衰竭。研究還發現應激可以通過下調抑鬱症患者大腦海馬及大腦皮質神經營養因子如腦源性神經營養因子（brain-derived nuerotrophic factor, BDNF）水平致神經元損傷和萎縮、影響神經元再塑和神經發生、使海馬體積改變[1]。CT、MRI檢查結果也證實抑鬱症患者均有不同程度的大腦皮質和海馬容積減少。同時大量證據發現癌症患者及荷瘤動物血漿中應激**包括GCS, ACTH等均有不同程度的改變。因此，我們提出假設：腫瘤作為一機體的惡性刺激，是否可影響機體的應激反應，*終誘發抑鬱狀態。我們擬通過懸尾實驗（tail-suspension test, TST）測定荷瘤小鼠不動時間來觀察其抑鬱狀態，並通過PCR技術來測定其海馬及大腦皮質中BDNF表達，從而從分子水平研究其抑鬱狀態發生的機製，初步闡明腫瘤與產生抑鬱的關係。懸尾實驗tail-suspension test TST
懸尾實驗tail-suspension test TST
1 材料與方法懸尾實驗tail-suspension test TST
懸尾實驗tail-suspension test TST
1.1 試劑及動物：鹽酸氟西汀（Fluoxetine）膠囊，由Eli lilly and companylimited生產，規格：20mg/每粒，批號：20040715。健康balb/c雄性小鼠，體重18+2g；雄性肝癌H22腹水瘤小鼠，均為上海斯萊克實驗動物有限公司提供。懸尾實驗tail-suspension test TST
1.2 動物分組及荷瘤模型的建立 隨機將健康小鼠分為3組，正常對照組，荷瘤組及荷瘤氟西汀處理組。取腹水瘤的種鼠，處死後抽取腹水液，生理鹽水稀釋4倍配製成瘤細胞懸液，約1×107個/ml,0.2ml皮下接種於小鼠右腋下。荷瘤加氟西汀組小鼠每日用氟西汀20mg/kg灌胃一次。
1.3 懸尾實驗 將小鼠倒置懸吊，在5分鐘內計算小鼠靜止的時間.
1.4 RT-PCR法測定大腦皮層組織BDNF的表達 小鼠處死後，取出海馬組織，抽提RNA，逆轉為cDNA。BDNF及beta-actin的引物序列分彆為5’-TCATTGGTAACCTCGCTCAT-3’; 5’-CCGAACCTTCTGGTCCTC-3 和5’-ACAGGCATTGTGATGGACTC-3’;5’-TTGATGTCACGCACGATTT-3。
1.5 實時定量RT-PCR測定海馬BDNF的表達 2-SYBR為PCR的綠色熒光標記，引物序列為5’-GAGTCTTTGGTGGTTTGTGA-3’及5’-GCTCGGGTAGTTCGCTTTA-3’。95°C持續15分鐘，然後經曆40個循環使cDNA擴增，每個循環包括15秒94°C高溫變性、30秒56°C低溫退火、30秒72°C延伸。懸尾實驗tail-suspension test TST
1.6 統計學分析 計量資料均以均數±標準差表示（Mean±s），采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為顯著性差異。懸尾實驗tail-suspension test TST
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2 結果懸尾實驗tail-suspension test TST
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2.1 荷瘤對小鼠TST的不動時間的影響 TST是經典的抑鬱行為學實驗，小鼠為克服不正常體位而掙紮活動, 但活動一定時間後, 出現間隙性不動, 顯示“失望”狀態, 因此，小鼠的不動時間反映了其抑鬱狀態。在本實驗中，分彆在第0天、第6天、第8天以及第12天測定小鼠的不動時間，發現隨著荷瘤時間的增長，小鼠的不動時間逐漸延長。而氟西汀連續處理12天可顯著縮短荷瘤小鼠的不動時間（圖1）。懸尾實驗tail-suspension test TST
圖1 荷瘤對小鼠TST不動時間的影響懸尾實驗tail-suspension test TST
Fig 1. Effects ofH22 tumor implantation on the immobility time (s) in the TST ofmice (Mean±s, n=10) 懸尾實驗tail-suspension test TST
**P<0.01 vs before tumor implantation；c P<0.01 vs 12days after tumor implantation
2.2 荷瘤對小鼠海馬BDNF表達的影響 實時定量PCR結果表明海馬組織中的BDNF表達下降，氟西汀處理12天後BDNF表達上調，與荷瘤模型組存在顯著差異（表1，圖2）。懸尾實驗tail-suspension test TST
表1.荷瘤對小鼠海馬BDNF表達的影響
Tab 1. BDNF level in the hippocampus of H22 tumor-bearing mice (Mean±s, n=5)
組彆 | 對照組
| 荷瘤模型組
| 荷瘤氟西汀處理組 |
RNA相對濃度 | 0.96±0.05 | 0.34±0.10** | 0.58±0.15b |
**P<0.01 vs before tumor implantation；b P<0.05 vs 12days after tumor implantation
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**
|
b |
圖2 實時PCR技術測定小鼠海馬BDNF水平
Fig 2. BDNF level in hippocampus byreal-time PCR (Mean±s, n=5)
**P<0.01 vs before tumor implantation；b P<0.05 vs 12days after tumor implantation
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2.3 荷瘤對小鼠皮層<%3
