慢性應激對大鼠海馬NGF、NT-3表達的影響
慢性應激對大鼠海馬NGF、NT-3表達的影響及應激停止後的變化
摘要：目的 探討慢性應激對大鼠海馬神經元NGF、NT-3蛋白表達的影響及其應激停止後的變化。方法 采用慢性強迫遊泳製作動物模型。運用open-field法觀察大鼠行為學的變化，運用**組織化學方法觀察大鼠海馬DG區、CA3區NGF、NT-3的表達。結果與對照組相比,實驗組1大鼠海馬CA3、DG區NGF、NT-3的平均灰度值顯著增加（p<0.05和p<0.01），實驗組2平均灰度值與對照組2相比同樣增加（p<0.05和p<0.05）。結論慢性應激使大鼠海馬NGF、NT-3表達降低，應激三十天後，其表達仍低於對照組。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
關鍵詞：慢性應激 海馬 NGF、NT-3 強迫遊泳porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
[中圖分類號] R395 [文獻標識碼] A
porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
Effects of chronic stress on the expression of NGF、NT-3 in hippocampusof the rats porsolt swimtest強迫遊泳實驗係統 forced swim
Bi Bo, Jin Kuihe，Zhu Yuzhang, et al.
Department ofPsychiatry and Medical Psychology, The First Affiliated Hospital,China Medical University, Shenyang 110001
Abstract: Objective To observe the changes ofNGF、NT-3 expression inhippocampus of the rats with the forced－swimming and the changes of NGF、NT-3 after poststress. Methods The protocol was established with the forced－swimming as the chronic stress model. Open－field test was executed to measure the behaviors of the rats. Immunohistochemistry was used to observe the changes of NGF、NT-3 expression in the hippocampus. Results Compared to the control group，the expression of NGF、NT-3 in CA3 region of the hippocampus and dendate gyrus(DG)of the rats was decreased morphologically. With the computerized image analysis, the gray degree increased significantly and the changes showed the same results after the poststress. Conclusion Chronic stress decreased the expression of the NGF、NT-3 in CA3 region and DG in the hippocampus of the rats and the changes showed the same results after the poststress.
Key words: chronic stress,hippocampus, NGF、NT-3,forced－swimming,
porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim porsolt swimtest強迫遊泳實驗係統 forced swim
神經生長因子(neuron growth factor NGF)是**個被發現、也是生物學功能了解得*清楚的一個神經營養因子。NGF對皮質、海馬、基底前腦的膽
堿能神經元有神經營養作用。[1]它和神經營養因子3(neurotrophin3, N T-3 )廣泛地分布在海馬、大腦皮層、中隔等**神經係統中,它們在神經保護、突觸再生、神經損傷後功能重建等方麵也發揮了重要作用。應激事件導致神經化學方麵的改變可能參與了抑鬱障礙的發生，此外，神經***、神經遞質和神經可塑性的改變在抑鬱障礙的發生中也起到十分重要的作用。[2] 本研究利用**組化的方法觀察NGF、NT3在慢性應激以及應激過後在海馬的表達變化，以了解NGF、NT3和抑鬱障礙的關係。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
1 對象與方法porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
1.1實驗動物porsolt swimtest強迫遊泳實驗係統 forced swim
成年Wistar雄性大鼠32隻（由中國醫科大學動物實驗室提供），體重160－180g。將實驗大鼠置於自然晝夜節律光照條件下，自由進食、飲水，每籠6-8隻，控製室溫於18～20℃。大鼠適應環境1周後，稱重，並采用 Open-field（開場）實驗測定行為，記錄大鼠5min內的動作行為表現，包括中央格停留時間、水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糞便粒數。依體重和Open-field實驗評分，將大鼠隨機分為四組，每組8隻，分彆為對照組1、對照組2、實驗組1和實驗組2。各組間體重和Open-field實驗評分均無顯著性差異。對照組每籠喂養4隻，實驗組的大鼠於單籠喂養。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
1.2 實驗方法porsolt swimtest強迫遊泳實驗係統 forced swim
將實驗組1和實驗組2的大鼠每天上午十點鐘放入長寬50cm×60cm、水深25cm、水溫恒定0℃的冰水玻璃缸中強迫遊泳5min，每天給予刺激一次，共21天。對照組1與對照組2的大鼠放在籠中群養，不給任何刺激。第22天殺死對照組1和實驗組1的大鼠, 實驗組2停止強迫遊泳和對照組2繼續喂養，30天後，處死動物。各組大鼠在被處死前均采用 Open－field法測定大鼠的行為並稱體重。處死方法：用****（50－60mg／kg）經腹腔麻醉，麻醉起效後將大鼠固定在灌流台上，剖開胸腔，經左心室快速灌注37ºC生理鹽水（含適量肝素）150－200ml，繼而灌注4%多聚甲醛溶液（用PBS配製，pH＝4）200－300ml，持續30－40min後，取腦組織並修塊。將腦修塊置於4％多聚甲醛溶液中固定48小時，梯度酒精脫水，石蠟包埋後，冠狀切片,片厚約7µm。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
通過ABC**組化染色方法檢測NGF、NT3蛋白的表達。切片經脫蠟、水化後入PBS（PH7.4），3%H2O210分鐘內去除過氧化物酶，切片用微波進行抗原修複，然後進行**組織化學ABC法染色。用兔抗鼠NGF、NT3作為一抗，工作濃度為1：200。用生物素化的羊抗兔IgG作為二抗，工作濃度為1：200。*後加ABC複合物，工作濃度為1；100，*後加DAB顯色液顯色5-10分鐘。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
每隻大鼠取雙側海馬CA3區DG區切片各兩張，在計算機圖像分析係統（Meta Morph／Ax70）上測量NGF、NT3平均光密度和平均目標灰度值(所測陽性細胞平均灰度),灰度單位分為256個等級,**反應的強弱與灰度值呈反比關係。
采用SPSS for Windows 10.0軟件分析，數據以均數加減標準差(x-±s）表示,組間檢驗采用t檢驗,p值取0.05。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
2 結果porsolt swimtest強迫遊泳實驗係統 forced swim
開場行為評定：實驗組與對照組的大鼠第21天的數據相比(表1)，慢性應激後實驗組大鼠的體重增加減少（t=－4.07，P<0.01），中央格停留時間延長（t=2.42，P<0.05），水平穿越格數減少（t=－5.40，P<0.01），豎立次數減少（t=－5.70，P<0.05），修飾次數減少（t=－3.00，P<0.01），糞便粒數無明顯差異（t=0.638，P>0.05）。應激後30天，實驗組2與對照組2相比，大鼠的體重增加減少（t=－2.80，P<0.01），中央格停留時間延長（t=3.13，P<0.05），水平穿越格數減少（t＝3.89，P<0.01），豎立次數減少（t=－2.73，P<0.05），修飾次數減少（t=－2.54，P<0.05），糞便粒數無明顯差異（t=0.527，P>0.05）。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
表1 A組大鼠開場行為的比較
體重(g) 中央格時間(s) 水平穿越格數 豎立次數 修飾次數 糞便粒數
|
對照組1 259.63±25.32 0.98±0.36 31.75 ±8.75 14.00±4.34 10.25±5.75 1.75±1.03
實驗組1203.88±29.34** 3.05±2.40* 19.50±6.78** 4.37±1.99* 3.37±2.97** 1.37±1.30
對照組2 323.38±20.00 0.70±0.42 29.75±9.57 12.88±5.84 9.63 ±3.16 2.13±1.55
實驗組2 295.50±19.79* 3.55±2.54* 15.37±4.21** 5.63±4.72* 6.13±2.30* 1.75±1.28 |
* *表示P<0.01 *表示P<0.05
實驗組1大鼠海馬CA3區DG區NGF、NT3陽性細胞與對照組1相比平均灰度值增加（P<0.05 和P<0.01）。實驗組2大鼠海馬CA3區DG區NGF、NT3陽性細胞與實驗組2相比平均灰度值增加（ P<0.05和P<0.01）。
表2 慢性應激和應激後大鼠海馬DG、CA3區NGF、NT3的表達
CA3區 DG區 porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim |
灰度值 灰度值 NGF NT3 NGF NT3
對照組1 182.45±0.37 164.56±0.21 179.24±0.54 154.28±0.77
實驗組1 187.25±0.87* 169.67±0.94** 183.49±0.21* 157.33±0.39*
對照組2 181.85±1.02 163.23±0.63 180.34±0.98 156.65±0.58
實驗組2 186.31±0.68* 170.30±1.22** 187.79±1.01** 162.79±0.98** |
* *表示P<0.01 *表示P<0.05 porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
3 討論porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
本動物模型利用長期強迫遊泳的中等強度應激造成分養動物抑鬱狀態。實驗結果表明,與對照組相比,實驗組大鼠的體重增加量明顯減少, 中央格停留時間延長，水平穿越格數減少，豎立次數減少，修飾次數減少，糞便粒數無明顯差異，提示慢性應激使大鼠出現抑鬱樣行為。停止慢性強迫遊泳刺激30天以後，上述改變依然存在，顯示應激停止後抑鬱樣行為持續存在。
慢性應激可以使海馬CA3區神經元的樹突發生持久的和不可逆的損傷，主要表現為樹突長度的縮短、分支數量的減少和海馬齒狀回神經元的再生障礙。[3，4]不斷有證據表明慢性應激是抑鬱發生的一個很重要的因素，其所引起的海馬結構和功能上的變化與抑鬱障礙的發生密切相關。[5]許多神經影像學和屍檢的研究提示抑鬱障礙的發生與某些特定神經網絡的神經可塑性損害相關。[6]例如，〕MRI的研究表明，抑鬱障礙的病人前額葉、海馬和紋狀體區的灰質部分減少，這些變化很可能是由於神經元的凋亡和神經營養過程的失調所導致的。神經營養因子合成的缺乏（NGF、NT3 BDNF、Bcl-2）使海馬和前額葉神經凋亡增加，這一改變很可能與抑鬱障礙病人認知功能的損害相關。[7] porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forcedswim
NG是迄今發現的**對正常神經細胞有營養作用,對損傷神經修複機能有調節作用的生物活性因子,NGF是一種多亞基蛋白組成的靶組織源性細胞因子,對神經組織的生存、發育、修複及神經功能的維護具有重要的作用。它是**神經係統中重要的生物活性物質之一,外源性NGF 能促進**神經****,維持其存活,減少病理性死亡。[8]神經營養因子3主要存在於海馬的齒狀回，在**神經元的再生，海馬的可塑性和記憶等方麵發揮重要的作用。[9]本研究的實驗結果表明，慢性強迫遊泳應激可以減少海馬神經元神經營養因子NGF、NT3的表達，而且應激停止三十天後，此兩種神經營養因子的表達仍然降低。由此可以推測慢性應激所致的抑鬱障礙模型鼠的海馬神經元的損傷和丟失可能與神經元的保護因子NGF、NG3的降低有關，而且此種改變在不給予任何**手段的情況下是不可逆的。,研究抑鬱障礙與NGF、NT3的關係將不僅為我們理解該**病因病理學機製、同時為研究和開發NGF、NT3這樣的新型抗抑鬱**提供一個嶄新的途徑。porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
參考文獻porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
1 Brice J. Williams , MariaEriksdotter-Jonhagen , Ann-Charlotte Granholm Nerve growth factorin treatment and pathogenesis of Alzheimer’s disease Progress inNeurobiology 80 (2006) 114–128 porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
2S. Hayley, M. O. Poulter, Z Merall, et al. The Pathgenesis ofClinical Depression: Stressor and Cytokine-Induced Alterations OfNeuroplasticity，Neuroscience 135 (2005) 659–678 porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
3Cheryl D. Conrad, What Is the Functional Significance of Chronic Stress-Induced CA3Dendritic Retraction Within the Hippocampus? Behavioral andCognitive Neuroscience Reviews, Vol. 5, (2006), 41-60porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
4 Margarines AM, McEwen BS.Stress-induced atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3neurons: comparison of stressor. Neuro-science,69(1995):83-88
5 Garcia R. Stress, synapticplasticity and psychopathology. Rev Neurosci
;13(2002):195–208.porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
6 Manji, H.K., Quiroz, J.A., S****, Jet al,. Enhancing neuronal plasticity and cellular resilience todevelop novel, improved therapeutics for difficult to-treatdepression. Biol. Psychiatry 15 (2003), 707– 742porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
7 Philippe Fossati, AndreiRadtchenko, Patrice Boyer Neuroplasticity: from MRI to depressivesymptoms European Neuropsychopharmacology 14 (2004) S503–S510porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
.8 Wyllie AH. Glucocorticoid - inducedthymocyte apoptosis is associated with endomuclese activation.Nature ; 284 (1980): 555 ～557
9 Kazuhiro Shimazu, Mingrui Zhao,Kazuko Sakata, et al, NT-3 facilitates hippocampal plasticity andlearning and memory by regulating neurogenesis Learn. Mem.13(2006): 307-315; porsolt swim test強迫遊泳實驗係統 forced swim
