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砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響（高架十字迷宮應用）
日期：2025-05-07 00:10
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摘要：
南台科技大學
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
摘要
根據世界衛生組織(World Health Organization; WHO)統計發現，目前全世界約有百分之三的人口罹患憂鬱症(depression)，而各種**所引起的負荷或失能中，精神**是*重要的因素，在公元1999年精神**已高達各種**或傷害所造成失能生命人年(Disability Adjusted Life Years, DALYs)的百分之十一點五，且預估到了公元2020年，將上升至百分之十五，其中又以憂鬱症占百分之三十六點五*多，因此世界衛生組織將憂鬱症、癌症以及艾滋病並列為二十一世紀的三大**及衛教預防重點工作。
砷是存在於自然界地表土壤及地下水中的元素。人類暴露砷化合物的途徑主要來自於職業暴露的工人以及來自於環境的暴露。過量的砷化合物暴露會造成的健康效應有許多方麵，包括癌症（如皮膚癌、膀胱癌、肝癌及腎臟癌等）、皮膚**、神經**、血管**（包括周邊血管，心血管**等）。三氧化二砷所引發的毒性為氧化壓力的產生，也包括反應性氧族的形成、脂質過氧化的增加，台灣西南沿海地區地下井水的砷含量很高，根據文獻有超過50萬人口曾暴露在此環境中而出現一獨特的周邊血管**—烏腳病。在先前的研究指出烏腳病流行區的心血管**的死亡率及盛行率均有增高的現象，相關研究亦指出累積砷暴露量與缺血性心臟病、高血壓等**有關，但與憂鬱症相關之研究極少。
本研究為探討砷暴露對憂鬱症動物模式之影響，砷暴露容易導致動脈硬化使胰島素耐受性異常，形成的高胰島素血症亦可引起脂質代謝異常，本研究利用動物實驗長期喂食三氧化二砷，並觀察相關生化值，如血中胰島素濃度、三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量變化，並在犧牲小鼠後，取肝臟、腦部、腎臟以及脂肪藉由高效液相層析儀定量出5-HT及單胺類神經傳導物質表現量，並透過腎臟、肝臟及腦部的組織切片方式，觀察其結構的完整和細胞的叢集情形，探討胰島素阻抗導致憂鬱症之相關機製。關鍵詞：砷、胰島素耐受性、憂鬱症、5-HT
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
**章研究動機與目的
砷（arsenic）是地殼（earth crust）的組成分之一，原子序33，分子量74.92，含量占所有元素的**十位，外觀看來成灰色，易碎，成結晶狀，在空氣中易失去光澤。常與氧、氯及硫形成無機化合物，廣泛存於空氣，水及土壤中，也會與碳或氫形成有機砷化物，常見於植物或攝食無機砷化物的微生物內。一般而言，無機砷毒性高於有機砷，除了廣泛存於自然界外，砷也普遍應用於工業、製造業、木材加工、農業、半導體製造及醫藥上，成為常見的環境汙染物；人類可經由飲用或攝取含砷井水、農產品、醫療行為或工商業行為所造成的砷汙染物，而受到砷暴露所帶來的傷害。砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
有關慢性砷暴露引起中毒的研究，可以分成兩大部分：**部分分為職業性暴露，包括采礦業、冶煉業及農藥使用者，**部分則為環境暴露，主要為飲水暴露。砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
當人體受到急性砷暴露中毒時，會引起腹瀉、嘔吐及肝和腎臟毒性。如接觸至Arsine(AsH3)氣體可引起溶血，嚴重時會產生急性腎管狀細胞壞死，*後導致腎衰竭。然受到慢性砷暴露中毒的症狀較不明顯，一般發生症狀如普通感冒，有體弱、**、昏睡等症狀發生。長期暴露時，則皮膚上會有黑色素沈積、發生皮膚炎、角質化、脫毛等病變出現。一些研究指出慢性砷中毒可導致腎臟病變及骨髓受損。長期受到砷暴露，嚴重會導致癌症，如肺癌、皮膚癌、肝癌、膀胱癌、腎癌等，及心血管、末梢血管病變發生。
在台灣，近年來半導體產業，成為當今*閃亮的明星產業。這兩年，光電半導體產業也急速地崛起加入生產行列，顯示這一波電子產業發展脈動仍持續蓬勃發展中，然這兩種產業於製程中均會使用砷元素與砷化合物作為原料，對於作業中之人員受到砷暴露的危害，也就令人需特彆關心了。先前研究指出，於晶圓廠中從事離子植入機台維修保養作業工程人員，在打開機台進行維修保養時，可能會遭受到砷暴露的危害，因此該維修保養的過程，是項潛在危害的作業。該研究亦指出人員的尿液中之總無機砷代謝產物濃度隨著工作後的時間而有上升的趨勢。經檢測從事離子植入機之維修工程師於維修後之尿中總砷代謝產物濃度為12.8~46.8μg/L(以肌酸酐濃度校正後之尿中總無機砷代謝物濃度為3.6~67.2μg/g creatinine)，證明維修保養工程人員有受到相當砷含量的暴露。
來自於環境的無機砷暴露則主要來自於飲水，由於砷是存在於地表自然界的元素，其天然形成的無機砷就很容易汙染了地表的水源，包括井水。人類為了取得較乾淨的飲水以免罹患腸胃道**就會挖井以取得較「乾淨」的飲水。如果居民飲用井水遭到砷的汙染，就有慢性砷暴露而中毒的機會。這種因飲水而造成慢性砷中毒的現象在台灣、孟加拉國、智利、匈牙利及日本等國家均出現過。在眾多死亡率的研究中，慢性飲水砷中毒在肺癌、腎臟癌、膀胱癌或泌尿係統癌症的標準化死亡比率，在智利、日本、台灣及孟加拉國)的研究中均有較高的趨勢，而皮膚癌在智利、台灣、孟加拉國的研究中有較高的現象。另外，蔡氏等)在台灣烏腳病流行區的研究中更發現除了上述癌症之外，該地區民眾尚有許多癌症均存在有較高的標準化死亡比率，如肝癌、喉癌、胃癌、大腸癌及**癌等。以上這些研究均是針對飲水高砷暴露（>50μg/l）的研究。而在較低砷暴露濃度的研究中，Buchet等人發現在每天吸收無機砷>35μg/day即會增加肺癌死亡率，陳氏等人的研究也顯示即使每天使用符合50μg/l的飲水標準仍會有出現罹患癌症的風險。慢性砷暴露造**體*重要的健康效應在於其會造**體癌症的產生在職業暴露方麵，作業勞工會有的砷暴露，主要來自於冶煉業過程中吸入所產生的含砷蒸汽而產生肺癌。而一般大眾的砷暴露則來自於環境暴露，尤其是來自於飲水中無機砷的暴露。居民長期飲用含無機砷的水源在眾多流行病學調查中顯示會造成多種癌症的發生包括皮膚癌、肺癌、膀胱癌、腎臟癌、肝癌以及**癌，而且有些具有劑量效應關係。
由以上眾多流行病學的研究顯示砷暴露會引發皮膚癌，肺癌，膀胱癌，腎臟癌，肝癌以及**癌的發生IARC在1987年即已將砷列為group 1A即人類確定致癌物。砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
在腦中風和有關砷中毒方麵的研究，根據兩篇分彆在台灣烏腳病流行區及宜蘭地區以問卷方式所進行的探討腦中風病人與含砷飲用水暴露量之關係的研究結果顯示，在宜蘭地區長期使用含砷井水的居民具有較高的腦中風盛行率，而在烏腳病流行區之居民腦中風死亡率的研究中顯示並無增加的現象，但該地區的腦中風同樣有較高的盛行率。在心血管**的研究方麵，該地區居民長期的井水砷暴露，無論在心血管**的盛行率及死亡率均有增加的現象，並且無機砷暴露和頸動脈內膜中腔間的肥厚度(intima-media thickness, IMT)具有良好的相關性存在著劑量效應關係。由此可知無機砷中毒和脂質代謝異常具有顯著的相關性。
近年來，許多研究也提出，脂肪酸組成的異常可能是引起憂鬱症的原因之一，脂肪酸可與甘油以及其它成分如：膽堿(choline)、肌醇(inositol)等物質結合構成磷脂質，儲存於組織中。磷脂質是腦部所有細胞膜結構的主要組成份，當細胞膜磷脂質組成改變，可能會造成細胞膜微黏滯性或神經傳導係統的改變，如血清素及(nor)adrenaline，此兩種物質已被認為與憂鬱症的精神病理機製有關。另外，Fehily等人、Ellis 及Sanders也發現，憂鬱症患者血漿磷脂質組成與正常組比較有顯著差異。由此推測，磷脂質脂肪酸組成改變在憂鬱症的精神病理學扮演重要角色。
脂肪異常，包括三酸甘油脂與LDL-C的偏高，以及HDL-C的偏低。在流行病學的調查研究中可以發現，在對冇有糖尿病的健康族群所進行的橫斷研究中，胰島素濃度與肥胖的確和脂肪代謝異常有關；也有研究發現，三酸甘油脂過高的患者體內，遊離脂肪酸與胰島素濃度都會比三酸甘油脂正常者來的高。而在追蹤性研究中，肥胖與胰島素對於後來的脂肪異常的發生具有預測力。此外，基線胰島素預測八年後三酸甘油脂的上升與HDL-C 的下降，以及體重減輕可以改善三酸甘油脂過高和HDL-C過低狀況，都證明體內胰島素上升與肥胖對血脂異常所會造成的影響。
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
遊離脂肪酸影響細胞的胰島素敏感性的機製可能有二。一是遊離脂肪酸和葡萄糖對於細胞而言都是能量分子，皆可轉化成乙酰輔脢甲(acetyl CoA)再進一步轉換出能量，因此二者間存在著競爭關係。當體內充滿大量的遊離脂肪酸與葡萄糖時，由於葡萄糖代謝的糖解反應(glycolysis)會因為細胞內的acetyl CoA或中間產物—檸檬酸(citrate) — 的增加而受到負回饋，因此*後細胞所利用的acetyl CoA主要來自遊離脂肪酸，進而影響到葡萄糖的正常代謝；前述肝細胞會因遊離脂肪酸而增加糖質新生，亦是因為糖解反應受到抑製所致。除此之外，在正常狀態下，肌肉與脂肪組織會受胰島素的調控而增加細胞膜上的葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter 4)；但當遊離脂肪酸升高，一方麵可能會影響該蛋白的基因表現，另一方麵降低胰島素受器後的訊號傳遞，因此會降低糖類代謝率，造成胰島素抗性的現象。
理論上，在胰島素抗性的狀態下，在脂肪組織進行脂肪分解以及外圍組織無法有效地代謝脂肪酸之下，肝臟增加其對遊離脂肪酸的吸收，進而當肝臟將遊離脂肪酸轉化為三酸甘油脂之後，以VLDL-triglyceride再送到血流中，因此VLDL-triglyceride量升高，此時VLDL上的apoC-III蛋白亦會增加。外圍脂蛋白脂肪酵素(lipoprotein lipase)的活性會受到apo C-III蛋白的乾擾而降低，同時apo C-III蛋白亦會乾擾肝臟對VLDL的回收，使得來自肝臟的VLDL-triglyceride 在無法被有效利用或移除而逐漸於血液中累積。又因為VLDL12 triglyceride的濃度上升，因此VLDL-triglyceride 和LDL/HDL之間藉由膽固醇脂轉移蛋白(cholesterol easter transferprotein)所進行的三酸甘油脂與膽固醇交換反應會增加，導致HDL-C所攜帶的膽固醇下降。加上胰島素抗性狀態下，肝臟脂肪脢的活性加強，加速肝臟對HDL-C的移除。砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
血清素(Serotonin, 5-Hydroxytryptamine,5-HT)於1948年Rapport等人由血液**分離出來，並之後證實存在於**神經係統。血清素廣泛存在於自然界動植物中，包括脊椎動物、水果、堅果類及毒蛇的毒液，血清素可以自然型態存在，並且有刺激**神經及周圍神經係統之活性。血清素除了可以從一般飲食中攝取，人體體內也能藉攝取飲食用色胺酸 (dietary tryptophan)從腸胃道吸收，然後和大型中性胺基酸 (large neutral amino acids (LNAAs): tyrosine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine)競爭進入**神經係統的途徑，進入後經由色胺酸氫化脢(tryptophan hydroxylase) 形成5-氫化色胺酸 (5-hydroxy- tryptophan)，再經由芳香族胺基酸去碳酵素 (AAAD: aromatic amino acid decarboxylase)而產生內生性血清素。血清素在體內會被單胺氧化酶(monoamine oxidase)和醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)很快代謝為5-hydroxy-indoleacetic acid (5-HIAA).
血清素是一種神經細胞之間相互通信的化學傳導物質，目前認為它與許多病症的病因及**有關，尤其是關於**神經係統，像控製疼痛、抑製食欲、焦慮感、驚恐感、興奮感、及睡眠習慣等情緒和記憶與學習等行為、體溫調節、心血管功能、肌肉收縮、*****調節等。在神經係統中，以serotonin作為神經傳遞物的神經元，主要調控的生理功能和運動活性、睡眠-覺醒-警覺回路(sleep-awake-alert circuit)、感覺神經訊息傳入、進食等動物行為相關。且serotonin神經元對其他神經元活性的調控是有穩定的作用。
長期服用抗憂鬱劑會降低血清素和正腎上腺素接受體的功能與表現，但會活化環狀磷酸腺苷（cyclicAMP）訊息傳導路徑，包括：增加PKA和轉錄因子CREB（cAMP response element-bindingprotein）的濃度。單胺接受體活化後導致Ca2+激酶濃度增加也可調節CREB的表現。活化cAMP訊息傳導路徑意味著血清素和正腎上腺素正向調節（up-regulated）了一些大腦功能。*近的研究發現腦內神經滋養因子BDNF（CREB 轉錄因子的目標物）也會在長期服用抗憂鬱劑後表現量增加。研究證實長期給予抗憂鬱劑會活化cAMP 訊息傳導路徑，進而增加了大腦海馬結構的BDNF mRNA 表現量。BDNF與神經的分化、生長及維持大腦成熟神經細胞的存活有關。有相關研究指出BDNF與憂鬱症的關連性：臨床大腦影像研究發現憂鬱症病人的海馬結構萎縮且BDNF mRNA表現量下降。綜論上述研究顯示了BDNF也許與憂鬱症的病理成因有著顯著的關連性。
本研究為利用高膽固醇飼料以及三氧化二砷誘導C57BL/6小鼠動脈硬化模式，監測相關生化值，如血中胰島素濃度、三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量變化，引發胰島素阻抗性造成脂質代謝異常，並利用十字形迷宮(EPM)測定觀察小鼠是否有憂鬱症行為產生，以探討砷暴露所造成脂動脈硬化以及胰島素耐受性異常對憂鬱症之影響，並再犧牲小鼠後，取肝臟、腦部、腎臟以及脂肪定量出5-HT以及單胺類神經傳導物質表現量。在組織病理檢查方麵，透過腎臟、肝臟及腦部的組織切片方式，觀察其結構的完整和細胞的叢集情形，以探討在長期砷暴露下誘發之胰島素阻抗影響憂鬱症動物模式之分子機製。
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
**章實驗材料與方法
**節、實驗動物與材料
實驗材料
2 %高膽固醇飼料、鼠科正常飼料(Basal diet, Product Code5755)、含EDTA采血管、三氧化二砷（As2O3）、胰島素（Insulin）、乙醇（Ethanol）、封片膠、血糖儀、血糖試紙片、注射針頭。
實驗動物來源
本實驗所使用的C57BL/6品係的小鼠由國家實驗動物中心購得，並飼養於奇美醫院實驗動物中心。小鼠分彆飼養於不鏽鋼籠中，自由取食及飲水。動物房溫度維持在21 ±2 ℃，相對濕度50-70 %，以自動定時器控製光照周期，08:00~20:00為光照期(light period)，20:00~08:00為黑暗期(dark period)。
**節、實驗動物模式設計
實驗動物模式設計如下：
實驗動物進入動物中心後先以正常飼料(Basal diet, Product Code 5755) 喂食二周，並隨機分為4組，每組10 隻，分彆進行蛇根堿(reserpine)誘導憂鬱症模式，以2mg/kg的劑量連續腹腔注射5天後，再依下列組彆：
【1】 6周雄性C57BL/6品係小鼠－給予正常飼料並任其自由取食及飲水，共喂食20周。
【2】 6周雄性C57BL/6品係小鼠+砷－給予正常飼料8周後，於飲用水添加砷(133g/ml)喂食12周，共20周
【3】 6周雄性C57BL/6品係小鼠+2 %高膽固醇飼料－給予內含2%高膽固醇之飼料，給予正常飲水及任其自由取食及飲水，共喂食20周。
【4】 6周雄性C57BL/6品係小鼠+ 2 %高膽固醇飼料+砷－給予2 %高膽固醇飼料8周後，並於飲水中添加砷（133g/ml）喂食12周，共喂食20周。
實驗期間依照各實驗測量需求時間點采取樣品進行相關分析：
每周測量及紀錄小鼠的體重，實驗期間依照各實驗測量需求時間點采取血液進行相關生化值分析及血清蛋白質分析，並於各設計時間點犧牲小鼠，取下大腦、小腦、肝臟、腎臟進行IHC染色、組織砷含量分析、血清三酸甘油脂等生化值分析、胰島素耐受性測試。
實驗設計及測試樣品采集時間點
品 係 | 隻數 | 組 彆 | 實驗 |
C57BL/6 正常飼料 | 10 | 喂食正常飼料20周 | §每兩周 -體重 -胰島素耐受性 -血清生化值分析(TG,TC,HDL,LDL) -血中蛋白質分析 -十字形迷宮(EPM) |
10 | 喂食正常飼料8周後，在飲用水中添加砷12周(133g/ml) | ||
C57BL/6 2 %高膽固醇飼料 | 10 | 喂食2 %高膽固醇飼料20周 | |
10 | 喂食2%高膽固醇飼料8周後，在飲用水中添加砷12周(133g/ml) |
第三節、血液生化值測試
將上述四組實驗動物，采血進行相關生化值檢測。使用采血管收及小鼠眼窩血液，以拇指及食指拉住眼睛後麵皮膚，讓眼球凸出，微離心管從內側眼角進入，經過結膜到眼球後方，輕輕轉動管子，血液會延管子流出，確認有血液流出後再以采血管承接，采得血液後對眼皮稍加壓力可止血。采取約0.5ml全血，經5000rpm 10分鐘離心後，取0.2ml血清以進行生化值實驗，血液生化值 (總膽固醇TC、三酸甘油脂TG、高密度脂蛋白HDL和低密度脂蛋白LDL) 是由Hitachimodel 7600 automatic analyzer以比色法原理測得。
第四節、胰島素耐受性測試（ITT）
依設計時間點將上述五組實驗動物，測量胰島素耐受性，於實驗進行前禁食8小時，接著腹腔注射胰島素0.5U/Kg。使用血糖儀MAJOR II在腹腔注射胰島素前以尾部取血測量一次血糖，注射胰島素後15、45、95、135、180分鐘測量一次血糖，分彆記錄後繪圖觀察曲線變化。
砷長期暴露下對胰島素耐受性依賴型憂鬱症動物**模式之影響暨相關分子機製探討（高架十字迷宮應用）
第五節、**動物模式建立_憂鬱症的誘發
舉臂式十字形迷宮(Elevated plus maze test)
高架十字迷宮是一種常用來檢測動物憂鬱及焦慮的行為測驗工具，此迷宮離地50cm高，路徑狀似中文的「十」字，四邊分彆由相對的開放端及封閉端所構成，可用來觀察動物進入開放端和封閉端的次數及時間、停留在正中開放空間的時間、動物頭部下探行為及動物的活動。
此儀器由兩個開放臂(30 ×5 cm)及兩個封閉臂(30×5 ×15 cm)，中以開放之正方形(5 ×5 cm) 相連接，距離地麵50 cm高所組成。將小鼠放入正方形處，麵向開放臂，在完全黑暗連續測定5 分鐘。並評估進入開放臂及封閉臂時間與進入開放臂及封閉臂次數。
評估指數 | 焦慮 | 抗焦慮 |
進入開放臂時間和次數 | ↓ | ↑ |
進入封閉臂時間和次數 | ↑ | ↓ |
第六節、數據處理與分析
本實驗數據處理及繪圖使用sigmaPlot軟件，實驗結果表示方法均為mean±SE，各組間顯著差異（p <0.05）則是使用sigmaPlot軟件中T-test計算。
第三章結果
圖一. 體重變化
圖一.體重變化
圖二. 十字迷宮(開放臂時間)
圖二.十字迷宮(開放臂時間)
圖三.十字迷宮(封閉臂時間)
圖四. 口服葡萄糖耐受性試驗
圖五. 口服葡萄糖耐受性試驗
圖六. 胰島素耐受性試驗
圖六
圖七. 總膽固醇量(total cholesterol)
圖八. 三酸甘油脂(triglyceride)
圖八
圖九.高密度脂蛋白/低密度脂蛋白
分彆為六組
**組正常對照組(喂食一般飼料)、**組喂食砷(As)、第三組喂食蛇根堿(reserpine)、第四組喂食蛇根堿(reserpine)與高膽固醇飼料(HFD)、第五組喂食蛇根堿(reserpine)與砷(As)、第六組喂食蛇根堿(reserpine)與高膽固醇飼料(HFD)+砷(As)
第四章結論
砷是存在於自然界地表土壤及地下水中的元素。來自於環境的無機砷暴露則主要來自於飲水，由於砷是存在於地表自然界的元素，其天然形成的無機砷就很容易汙染了地表的水源,人類暴露砷化合物的途徑主要來自於職業暴露的工人以及來自於環境的暴露。過量的砷化合物暴露會造成的健康方麵有許多影響,砷暴露容易導致動脈硬化使胰島素耐受性異常，形成的高胰島素血症亦可引起脂質代謝異常,當人體受到急性砷暴露中毒時，會引起腹瀉、嘔吐及肝和腎臟毒性。如接觸至Arsine(AsH3)氣體可引起溶血，嚴重時會產生急性腎管狀細胞壞死，*後導致腎衰竭。
本實驗為探討砷暴露對憂鬱症動物模式之影響，砷暴露容易導致動脈硬化使胰島素耐受性異常，形成的高胰島素血症亦可引起脂質代謝異常，本研究利用動物實驗長期喂食三氧化二砷，並觀察相關生化值，如血中胰島素濃度、三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量變化，並在犧牲小鼠後，取肝臟、腦部、腎臟以及脂肪藉由高效液相層析儀定量出5-HT及單胺類神經傳導物質表現量，並透過腎臟、肝臟及腦部的組織切片方式，觀察其結構的完整和細胞的叢集情形，探討胰島素阻抗導致憂鬱症之相關機製。
