人骨髓基质细胞脑移植改善大鼠缺氧缺血性脑损伤

【摘要 】 目的 观察人骨髓基质细胞 (BMSCs)移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (H I BD)的保护作

用 ,探讨 BMSCs脑移植** H I BD的可行性。方法 36只新生大鼠随机分为对照组、 H I BD组和移植组

(均 n = 12)。H I BD组和移植组大鼠 7日龄时结扎左侧颈总动脉后吸入 8% 氧气 2 h制成 H I BD模型。对

照组仅分离左颈总动脉 ,不予结扎和缺氧。分离培养人 BMSCs,损伤后 3 d将 BMSCs立体定位脑移植到移

植组大鼠左侧感觉运动皮层。3～4周龄时 ,观察大鼠行为学和组织学的改变 ,并用**荧光检测移植细胞

的存活情况。结果 缺氧缺血后 3周 , H I BD组海马 DG区和皮层单位面积内神经元数目较正常组减少 [海

马 DG区: (39 . 2 ± 5 . 6) 个 vs (51 . 1 ± 3 . 9)个 , P < 0 . 001;皮层: (12 . 3 ± 3 . 0)个 vs (17 . 8 ± 3 . 0)个 , P <

0 . 001 ]。BMSCs移植后海马 DG区和皮层单位面积内神经元数目 [海马: ( 44 . 9 ±3 . 1)个 ,皮层: ( 17 . 5 ±

3 . 1)个 ]较 H I BD组增加 ( P < 0 . 01)。与对照组比较 , H I BD组在 T迷宫、 感觉运动功能测试中表现出明显

的不足。BMSCs脑移植组各项行为学测试成绩较 H I BD组均有明显改善。**荧光显示移植后 3周 ,BM2

SCs在脑内存活。结论 BMSCs脑移植可以改善新生鼠 H I BD。

尽管围产医学取得了很大进展 ,缺氧缺血性脑病

(H IE)的发病率并没有明显下降 ,它仍是脑瘫、 精神发

育迟滞、 学习障碍和癫痫的常见原因[ 1 ]

。虽然目前

H IE的机制研究取得了很大进展 ,但是临床仍缺少特

异性**手段 ,以对症支持综合**为主。近来发现

骨髓基质细胞 (BMSCs)移植可以**成年鼠大脑中

动脉阻断 (MCAO)模型缺血性脑损伤 , 但 BMSCs移植

**新生鼠缺氧缺血性脑损伤 (H I BD)是否也有效尚

缺乏相关的研究。新生动物 H I BD属于弥漫性脑损

伤 ,与成年大鼠 MCAO模型易损部位以及发病和修复机制均有不同。因此我们进行了以下实验探讨BMSCs

移植对新生大鼠 H I BD有无保护作用。

材料与方法

一、 人 BMSCs的原代培养及传代

取健康胸外伤病人肋骨 (由胸外科提供 ) ,无菌状

态下 ,用 DMEM完全培养基仔细冲洗骨髓腔 ,将冲洗

下的组织反复通过 1ml的注射器 ,制备成细胞悬液 ,

镜下计数 ,稀释后以 1 ×10

7

接种于 75 cm2

培养瓶中。

24 h后换液 ,去除未贴壁的细胞。待贴壁细胞 90%融

合后 , 0 . 25%胰蛋白酶消化传代。

二、 动物分组及缺氧缺血脑损伤模型的制备

36只新生清洁级 Sp rague2 Dawley大鼠 (由中南大学实验动物中心提供 ) ,雌雄不拘 ,体质量在 12 g以

上 ,随机分为对照组 , H I BD组和 BMSCs移植组 ,每组

12只。按照 Rice方法[ 4 ]

制作 H I BD模型。简述为:分

离、 结扎、 并剪断左颈总动脉 ,而后将之放入 8%的氮

氧混合气的 36℃ 恒温箱 2 h。12只对照组大鼠于 7日

龄行假手术 ,仅予以分离左颈总动脉 ,不予结扎和缺

氧。移植组大鼠在缺氧缺血后 3 d进行移植。

三、 间接**荧光

正常山羊血清室温封闭 30min;加入一抗 4℃冰

箱过夜; PBS洗 5min × 3次;加入二抗室温 1 h; PBS洗

5min × 3次;荧光显微镜下观察。BMSCs的鉴定所用

一抗分别为小鼠抗 CD11b单抗 (1: 200, Santa Cruz) ;

小鼠抗 CD90 . 1单抗 ( 1: 200, Chemicon) ;兔抗 CD34

多抗 ( 1: 200, Santa Cruz) ;兔抗 CD59多抗 ( 1: 200,

Santa Cruz) ;小鼠抗纤粘连蛋白单抗 ( 1: 200, Santa

Cruz)。体内外人 BMSCs的识别所用一抗为小鼠抗人

核单抗 (1: 30, MAB1281, Chemicon)。二抗为山羊抗

小鼠 I gG2 Cy3 (1: 100, Sigma) ,或山羊抗兔 I gG2 Cy3 (1:

100, Sigma)。

四、 BMSCs移植

取第 5代 BMSCs,洗涤离心后 ,调整活细胞密度为

5 × 10

7

/ ml。应用立体定位仪 ( ST OELTI NG T L 2型 ,

美国 ) ,以左侧感觉运动皮层区 (前囟前 0 . 3mm;前囟

左 2mm,深 1 . 5mm)为移植点 ,注入 2μl BMSCs细胞

悬液 (5 × 10

4

/μl)。

五、 行为学测试[ 2 ]

1 . T迷宫测试[ 2 ]

( T maze test) :每只动物每日测

试 5次 ,每次间隔 15min,连续 4 d,共 20次。

2 .感觉运动功能测试: 34日龄时进行测试[ 3 ]

。包

括足错误 ,肢体放置和试验具体方法见钟乐[ 2 ]

和王

霞[ 3 ]

报道。

六、 组织切片制备

28日龄时进行。10%水合氯醛麻醉 ,打开胸腔 ,

左心室穿刺 ,注入冷**生理盐水 ,同时剪开右心耳让

血流出 ,直至流出的液体变清为止 ,再与以 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS灌注固定。断头取脑 ,置于 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS溶液中固定 72 h以上。常规脱水及石蜡

包埋 ,切片厚 3μm。

七、 尼氏染色

取前囟和前囟后 3mm部位切片 , 0 . 1%甲苯胺兰

60℃ 温染 1min,水洗 , 70%、 80%酒精脱水 , 95%酒精

镜下分化 ,直至细胞核和背景为淡蓝或无色, 100%酒

精脱水 ,松节油透明 ,封片。光镜下 ( × 200)计数皮层

和海马 DG区单位面积神经元数目。

八、 统计学分析

全部资料用 SPSS11 . 0软件包统计软件处理。

结 果

一、 BMSCs的原代培养与传代刚接种时 ,培养瓶中有大量的悬浮细胞。24 h换

液后可见部分细胞贴壁 ,仍为圆形。骨髓中的造血干

细胞不会贴壁 ,可在换液中逐渐除去。贴壁的细胞渐

增多 ,为成纤维细胞样细胞 ,胞体细长呈纤维状 ,细胞

核较大 ,为椭圆形。7 d时 ,细胞呈簇状生长 ,分布不

均 ,显示出集落生长趋势。至 2周时 ,细胞融合成单

层。传代细胞 24 h内完全贴壁 , 3 d进入对数生长期 ,

7～10 d后即可融合。

二、 **荧光

培养的细胞表达 CD59, CD90 . 1和纤粘连蛋白等

抗原 ,不表达 CD11b, CD34等白细胞和造血干细胞抗

原 ,说明其为 BMSCs。小鼠抗人核抗体 (MAB1281)能

识别来源于人的细胞核 ,不识别其他物种的细胞核 ,结

果显示人 BMSCs表达人核抗体 ,而对照的大鼠 BMSCs不表达人核抗体。

三、 BMSCs移植对缺氧缺血后神经元损伤的影响

缺氧缺血导致了神经元损伤 ,使 H I BD组海马 DG

区和皮层单位面积内神经元较正常组减少 [ ( 39 . 2 ±

5 . 6)个 vs (51 . 1 ± 3 . 9)个 , P < 0 . 001; (12 . 3 ± 3 . 0)个

vs (17 . 8 ±3 . 0)个 , P < 0 . 001 ]。BMSCs移植后海马

DG区和皮层单位面积内神经元数目较 H I BD组增加

[ (44 . 9 ±3 . 1)个 , P = 0 . 003; ( 17 . 5 ±3 . 1 )个, P <

0 . 001 ]。

四、 BMSCs移植对缺氧缺血后行为学损伤的影响

1 . T迷宫测试:各组在连续 4 d的试验中 ,随着天

数的增加 ,对照组和移植组正确率逐渐增高 ,而 H I BD

组正确率上升不明显 ,说明学习能力较差。在第 4天

时各组间正确率的差异有显著性意义 ( F = 24 . 772, P

< 0 . 001) , H I BD组的正确率较对照组和移植组显著降

低 ( P < 0 . 001, P = 0 . 004) ,移植组的正确率低于对照

组 ( P = 0 . 007)。见表 1。

表 1 各组 T迷宫测试正确率 ( n = 12, % , x ±s )

组别 1 d 2 d 3 d 4 d

对照组 61 . 7 ± 18 . 0 81 . 7 ± 13 . 4 86 . 7 ± 15 . 6 98 . 3 ± 5 . 7

H I BD组 58 . 3 ± 27 . 8 63 . 3 ± 36 . 0 68 . 3 ± 26 . 2 66 . 7 ± 15 . 63 3

移植组 60 . 0 ± 19 . 1 70 . 0 ± 18 . 1 73 . 3 ± 21 . 5 86 . 7 ± 17 . 13 △

F值 0 . 077 1 . 719 2 . 325 24 . 772

P值 0 . 930 0 . 190 0 . 110 0 . 000

注:与对照组比较 3

P› 0. 05,

3 3

P› 0. 01;与 H I BD组比较 △ P›

0. 01

2 .感觉运动测试:足错误:各组的足错误右左差值

差异有显著意义 ( F = 15 . 675, P < 0 . 001) , H I BD组右

左差值 (3 . 00 ± 1 . 04)较对照组 (0 . 67 ± 1 . 30)和移植

组 (0 . 33 ± 1 . 44)高 (均 P < 0 . 001) ,说明该组大鼠左

右运动不对称 ,右侧差于左侧。移植组与对照组比较

差异没有显著意义 ( P = 0 . 525)。

姿势反射:各组大鼠得分情况见表 2。对照组均

为 0分 ,而 H I BD组仅 8例为 0分 ,两组差异有显著意

义 ( Z = - 2 . 145, P = 0 . 032) ;移植组 11例为 0分 ,较表 2 各组大鼠姿势反射不同得分情况比较 (例数 )

组别 鼠数 0分 1分 2分

对照组 12 12 0 0

H I BD组3

12 8 4 0

移植组 12 11 1 0

注:与对照组比较,

3

P› 0. 05

H I BD组增多 ,但两组间差异无显著性 ( Z = - 1 . 476,

P = 0 . 140)。

肢体放置:对照组与移植组大鼠的得分差值绝大

多数为 0分 (百分率分别为 91 . 67%和 100% ) ,而

H I BD组的得分差为 1～4分 (1～4分得分百分率分别为 16 . 67%、 33 . 33%、 16 . 67%、 33 . 33% ) ,与对照组和

移植组比较差异有显著性 ( Z = - 4 . 349, P < 0 . 001; Z

= - 4 . 4, P < 0 . 001)。

五、 移植后 BMSCs的检测

单克隆抗人核抗体 (MAB1281)能识别移植到大

鼠脑内的人 BMSCs。在移植部位可见大量阳性细胞

延针道分布 ,大量分布于移植点周围 ,向脑实质内扩

散 ,随着移植点距离的增大阳性细胞逐渐减少