运动训练对脑梗死大鼠行为学及

摘要 目的: 研究运动训练对脑梗死大鼠行为学的影响并从神经可塑性角度探讨其机制。方法: 用线栓法制作大鼠
大脑中动脉闭塞(MCAO)脑梗死模型, 56 只 Wistar 大鼠随机分为假手术组、 模型组和康复组。康复组于手术后 5 天
开始进行滚筒、 转棒、 平衡木、 网屏训练, 每日 40min, 每周 6 次, 共 5 周, 假手术组与模型组则维持原来生活状态。
对大鼠进行神经功能、运动能力和学习记忆能力测评观察其行为学变化, **组化法观察缺血区神经丝蛋白 200
(NF200)的表达变化。结果: 康复组大鼠神经功能、 运动能力、 学习记忆能力优于模型组, 神经功能在 3 周差异有显著
性意义( P<0.05) , 其转棒实验和平衡木实验在 3 周、 5 周( P<0.01—0.05)差异有显著性意义, 网屏实验在 3 周、 5 周差
异有显著性意义( P<0.05) , 学习记忆能力在 5 周有极显著性意义( P<0.01)。康复组大鼠缺血区 NF200 蛋白质阳性表
达较模型组增多, 在 3 周时差异有显著性意义( P<0.05) , 5 周时有极显著性意义( P<0.01)。结论: 运动训练促进脑梗
死大鼠神经功能、 运动能力、 学习记忆能力的恢复, 其机制可能与缺血区 NF200 蛋白质表达上调有关。
关键词 脑梗死; 大鼠; 运动训练; 行为学; 神经丝蛋白 200
中图分类号:R743,R493 文献标识码: A 文章编号: 1001- 1242(2006)- 11- 0980- 05
Effects of motor tr aining on behavior and expr ession of NF200 in cer ebr al infar ction r ats/YANG Min,
YU Qian, HE Chengsong,et al.//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine, 2006, 21(11):980—984
Abstr act Objective:To study the changes of behavior and expression of neurofilament - 200 (NF200) in cerebral
infarction rats after motor training. To discuss the mechanism of behavior rehabilitation and the plasticity of the
central nervous systems (CNS). Method:An animal model was made by the middle cerebral artery occlusion(MCAO).
Fifty- six 2 - month old male Wistar rats were divided into 3 groups randomly: 8 rats in sham- operated group
(sham), and 24 rats in rehabilitation group and model group respectively. Motor training(balancing, grasping, rotating
and walking exercises) were applied in rehabilitation group from post operation 5d, 40min/d, 6 times per week, for
5weeks while those in sham group and model group were kept in their original living state. Bederson neural func-
tion, balancing wood, rotating bar, and net screen were tested at the 1st, 3rd and 5th week after operation respec-
tively. The expression of NF200 in ischemic area was observed immunohistochemically. Result:Bederson neural
function in rehabilitation group exceeded that in model group, showing significant differences at the 3rd week (P<
0.05). Motor ability in rehabilitation group was better than that in model group. Compared with model group, the
function of rotating bar and balancing wood in rehabilitation group was significantly different at the 3rd week (P<
0.01) and the 5th week (P<0.05); net screen function was significantly different at the 3rd and 5th week (P<0.05).
Both learning and memory abilities were improved obviously in rats after motor training (P<0.01). Conclusion:Motor
training can promote the recovery of neural function, ability of motor, learning and memory in cerebral infarction
rats, which may be related to NF200 expression upregulation in brain ischemic area.
Author′ s addr ess Dept. of Rehabilitation Medicine, Luzhou Medical College,Sichuan Province,646000
Key words cerebral infarction; rats; motor training; behavior; neurofilament200
脑梗死是神经系统的常见病和多发病, 患者常
有相应的运动、 感知觉、 学习记忆等行为能力障碍,
给社会和家庭带来沉重负担, 这就需要采用康复治
疗技术提高患者的生存质量和改善其功能障碍。运
动是**神经系统*有效的刺激形式, 所有的运动
都可向**神经提供感觉、 运动和反射性传入。 运动
对大脑的功能重组和代偿起着重要作用。Stroemer
等[1]
证实神经元轴突的发芽和突触形成与动物的行
为学恢复密切相关。神经丝蛋白( neurofilament, NF)
是神经元的结构蛋白, 是神经元所特有的细胞骨架,
对维持神经元的形态、结构及生理功能都具有重要
意义, 它代表着神经元的功能和联系。 根据其分子量
1 四川省泸州医学院附属医院康复医学科, 646000
2 通讯作者: 余茜(四川省泸州医学院附属医院康复医学科)
作者简介: 杨敏, 女, 硕士, 主治医师
收稿日期: 2005- 11- 17
的大小不同分为 NF60、 NF160 和 NF200 三种亚单
位, NF200 是 3 种 NF 蛋白的重要成分, 主要存在于
神经元轴突的远侧部分。因此,可以用磷酸化 NF200
蛋白质作为神经元轴突的标记物, 了解运动训练对
神经元轴突的可塑性影响, 初步探讨运动改善脑梗
死大鼠行为学影响的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
健康雄性 Wistar 大鼠 56 只, 体重 280± 50g, 周
龄 8 周, 由泸州医学院实验动物科提供。 分为假手术
组、 模型组(脑梗死自由活动组)、 康复组(脑梗死运
动训练组) , 其中模型组和康复组各分手术后 1 周、 3
周、 5 周 3 个时点, 每组各 8 只大鼠。
1.2 局灶性脑缺血模型
按照小泉线栓法制成右侧大脑中动脉缺血梗死
模型[2]
。用 1%的****钠按照 30—40mg/kg对大
鼠进行腹腔麻醉, 固定于手术台上, 颈部右旁中切开, 分离右颈总动脉、 颈内动脉、 颈外动脉。 在翼腭动
脉起始部置一血管夹, 结扎切断颈外动脉, 在颈外动
脉的起始部剪一直径 0.2mm的小口, 将预先用紫药
水煮过且染成紫色的强力尼龙钓鱼线 ( 直径
0.22mm, 长 20mm) , 离头端 4mm处均匀地涂上一层
聚氨酯轻漆, 使其头端形成一光滑的锥形, 头端直径
约 0.25mm。线栓从颈外动脉残端插入, 经颈动脉分
叉后沿颈内动脉入颅, 至大脑前动脉, 稍感阻力时停
止, 插入深度从分叉部计约 17—19mm, 然后用手术
线结扎颈总动脉分叉处, *后缝合皮肤, 手术完毕后
放回鼠笼正常喂食和饮水, 术后注意对动物进行保
温。 假手术组只是在动脉内不插线, 其余步骤与模型
组和康复组完全一致。模型成功标志是动物苏醒后
表现为提尾时左侧前肢内收屈曲; 同侧 Hornor 征;
爬行时向左划圈; 站立时左侧倾倒。 凡具有上述四项
体征者列入研究对象。
1.3 运动训练
康复组于术后休息 4d, 从第 5d 起开始采用自
制仪器进行运动训练:①滚筒网状式训练仪: 为一长
100cm, 直径 60cm 的圆形网状仪器, 底座有一固定架, 一端有一手摇柄, 将大鼠放于其中让其被动跑
笼, 训练大鼠抓握、 旋转及行走能力。 ②平衡训练: 将
大鼠放于距地面 5cm 高, 长 150cm、 宽 2cm 的方木
棒上, 用食物诱导其行走, 训练平衡能力。③网屏训
练: 将大鼠放于网眼 1cm× 1cm, 网宽 50cm× 40cm 的
网屏上, 网屏距地面高度 80cm, 下铺 12cm 厚的海
绵。网屏由水平逐步垂直并保持 5s, 观察大鼠是否从网屏上掉下来或用前爪抓住网屏。大鼠在网屏上
的时间越长反映肌力越好, 训练大鼠的抓握能力及
肌力。④转棒训练: 为一长 150cm, 直径 4.5cm的空
心铝棒一根, 其中点固定在 3r/min 的转动器上, 分
别向左右交替转动, 以训练其动态平衡。 以上训练每
天共计 40min, 每周 6d。
1.4 神经功能、 运动功能及学习记忆能力的评定
假手术组于术后 2h 进行神经功能评分, 术后 1
周进行运动能力评分。模型组和康复组于手术后各
时点进行神经功能评定和运动能力评分, 在手术后
5 周采用 Y-迷宫进行学习记忆行为学测试。神经功
能评分根据 Bederson 等[3]
制订的评定方法进行。平
衡木测评, 转棒测评及网屏实验测评按照各自的评
分标准进行[4]
。
Y-型迷宫测试[5]
: Y-型迷宫为一三等臂式迷宫,
每臂顶端设有一信号灯, 以此提示 “危险区” 。 信号灯
亮 6s, 此臂即为危险区, 通以 36V交流电, 刺激大鼠
在通电后从所在的亮臂跑到暗臂。训练中始终有一
臂为**区, **区以无规则的次序变换。 实验在安
静、 光线较暗的环境中进行。实验前, 将大鼠放入迷宫, 使其适应 5min, 然后开始实验。大鼠在通电后从
所在亮臂跑到另一亮臂记为错误, 跑到暗臂记为正
确。每天训练 30min, 连续刺激 10 次后大鼠休息
2min, 记录大鼠学会(连续 10 次训练中有 9 次正确
即认为 “学会” )所需的训练次数, 训练次数越少的表
明大鼠学习能力越强, 以此作为判断大鼠学习分辨
能力的指标。
1.5 取材及**组化
假手术组 8 只动物在手术后 1 周评定完后取
材, 模型组和康复组在手术后各时点评分进行完后
分别取材。以 1%的****钠腹腔注射麻醉后, 固
定于操作台上, 迅速开胸, 经左心室插管至主动脉快
速灌注肝素生理盐水 100ml, 再以 4%多聚甲醛行心
脏灌注(持续 15min) , 取脑组织置于 4%多聚甲醛溶
液中固定过夜, 移入梯度酒精固定, 取右侧大脑组织
行常规石蜡包埋。
用石蜡切片机行连续冠状切片 ( 片厚 4—
6μ m)。烘干。切片经常规脱蜡至水。3%双氧水, 室
温 5—10min 灭活内源性酶, 蒸馏水冲洗 3 次; 热修
复抗原: 滴加复合消化液 1 滴在切片上, 将切片放入
染缸, 置于 PBS液中, 微波炉加热沸腾, 冷却后重复1 次, 冷却后 PBS液冲洗 3 次; 抗原修复液 1 滴滴加
在切片上, 室温 8min, PBS液洗涤 3 次; 滴加适量一
抗小鼠 BM0100( 1∶ 200) , 37℃水浴箱孵育 1h; PBS洗
涤, 2min× 3 次; 滴加二抗小鼠 SA1021( 1∶ 200) , 37℃水浴箱孵育 20min; PBS洗涤, 2min× 3 次; 滴加试剂
SABC, 37℃水浴箱孵育 20min; PBS 洗涤, 5min×
次; DAB显色: 取蒸馏水 1ml, 滴加试剂盒中 A、 B、
液各 1 滴, 混匀后滴加到切片; 室温显色, 显微镜下
控制显色时间, 约 12—15min, 蒸馏水终止显色; 每
组随机选 1 张进行苏木素复染, 脱水、 透明、 封片, 显
微镜观察, 数码相机照相。采用 IS- 44OO图像分析
系统对各组**组化实验结果进行定位、 定性、 定量
统计: 用 MLAS- 1000 图像分析仪, 在 400 倍下进行
图像分析, 每组 5 张切片, 每张切片 5 个视野, 由计
算机处理系统测定各组 NF200 阳性纤维的光密度
( optical density, OD) , 所有 OD 值测量都是在相同
的光学、 光源条件下完成。
1.6 统计学分析
应用 SPSS11.5 对数据进行统计学分析。 P<0.0
为差异有显著性意义。对大鼠神经功能、 运动能力
学习记忆能力测评结果采用 t 检验进行两两比较
对**组化阳性纤维图像分析仪结果进行单因素方2 结果
2.1 行为学测试结果
假手术组共 8 只大鼠, 在手术前 1 天进行神经
功能和运动能力测评,其神经功能、 转棒行走训练、
平衡木步行训练、 网屏训练评分均为 0 分, 其手术后
2h 神经功能评分也为 0 分, 即假手术组术后无神经
缺失症状。假手术组于手术后 1 周进行运动能力评
分, 其转棒行走、 平衡木行走、 网屏训练三项评分均
为 0 分。表明只进行手术过程而不穿线不会造成大
鼠神经和运动功能缺失。
神经功能评分和运动能力评分, 康复组优于模
型组, 神经功能在手术后 3 周两组比较差异有显著
性意义( P<0.05) ; 转棒行走训练和平衡木步行训练,
术后 3 周模型组与康复组比较有高度显著性意义
( P<0.01) , 术后 5 周比较差异有显著性意义 ( P<
0.05) ; 网屏实验, 在手术后 3 周和 5 周比较差异有
显著性意义( P<0.05) , 见表 1。两组大鼠在手术后 5
周进行学习记忆能力测评, 结果显示康复组 Y- 型迷
宫学习分辨能力明显优于模型组, 其达到掌握标准
所需次数明显少于模型组, 两组比较有高度显著性
意义( P<0.01) , 见表 2。
2.2 NF200 染色结果及阳性产物颗粒图像分析仪
统计结果
2.2.1 **组化染色结果: 在光学显微镜下, NF200
**组化染色显示: 假手术组大鼠大脑皮质 NF200阳性表达主要为一些不同走向的神经纤维, 少见有
神经细胞。阳性纤维着色深褐色, 排列规则, 纵横交
错, 分布密集, 粗细均匀, 纹理清晰, 呈条索状走向。
模型组和康复组在手术后 1 周均可见梗死灶中央的
NF200 阳性纤维显著减少, 排列紊乱, 分布稀疏, 粗
细不均匀, 着色浅淡, 纤维变短, 多处出现串珠样改
变, 条索状走向中断, 两组在梗死灶边缘区可见散在
的 NF200 阳性神经元。在手术后 3 周, 模型组梗死
灶中央区 NF200 阳性纤维开始增多, 排列紊乱, 康
复组阳性纤维数量明显增多, 纤维明显增粗并扭曲,
染色加深, 呈辐射状, 由梗死灶周边向梗死灶中央延
伸。在手术后 5 周, 模型组阳性纤维较前稍有增多,
仍较紊乱, 康复组 NF200 阳性纤维排列整齐, 染色
均匀, 分布密集, 纹理清晰(图 1—3, 见后置彩色插
页 1)。
2.2.2 NF200 阳性产物图像分析仪统计结果: 采用
图像分析仪, 对每张切片随机取上下左右中 5 个视
野, 测定 NF200 阳性产物信号的面积(即占当时视野面积的百分比) , 测定其阳性产物平均 OD值, 并
减去背景光密度值, 得到校正光密度值。 统计结果显
示: 模型组和康复组手术后 1 周 NF200 阳性纤维光
密度值与假手术组比较有极显著性意义 ( P<0.01) ,
在手术后 1 周模型组和康复组比较差异无显著性意
义( P>0.05) , 在手术后 3 周模型组和康复组比较差
异有显著性意义( P<0.05) , 术后 5 周比较有极显著
性意义( P<0.01) , 见表 3。
表 1 模型组和康复组运动及神经功能评分 (分, x± s)
项目 组别 手术后 1 周 手术后 3 周 手术后 5 周
神经功能 模型组 2.13± 0.64 1.38± 0.52 0.50± 0.53
康复组 1.88± 0.64 0.63± 0.52① 0.25± 0.46
转棒行走测评 模型组 2.38± 0.52 1.50± 0.53 0.88± 0.64
康复组 2.00± 0.53 0.63± 0.52② 0.25± 0.46①
平衡木行走测评 模型组 3.50± 0.53 2.88± 0.64 2.00± 0.53
康复组 3.00± 0.76 1.88± 0.64② 1.38± 0.52①
网屏实验 模型组 1.88± 0.64 1.25± 0.46 0.63± 0.52
康复组 1.63± 0.52 0.63± 0.52① 0.13± 0.35①
两组比较:①P<0.05;②P<0.01
表 2 模型组和康复组学习记忆能力评分 ( x± s)
组别 动物数 Y- 迷宫学习分辨能力
模型组 8 103.38± 12.35
康复组 8 70.88± 9.40
表 3 各组 NF200 阳性纤维表达 OD 值比较( x± s, n=40, %)
组别 手术后 1 周 手术后 3 周 手术后 5 周3 讨论
实验中对脑梗死大鼠行为学评估分神经功能、
假手术组 27.20± 2.95 无 无
模型组 12.35± 2.76① 13.43± 2.95 16.13± 3.24
康复组 13.13± 3.10① 15.25± 3.29② 21.10± 4.02③运动能力和学习记忆三个方面。神经功能评估可以
反映缺血性损伤的程度, 而且与大脑皮质缺血性坏
死神经元的数目密切相关[6]
。 本结果表明运动训练能
明显改善脑梗死大鼠的神经功能、 运动功能、 学习记
忆能力。 发现运动训练能促进**在结构和功能上的
可塑性变化。运动使脑梗死大鼠早期( 1—2 周)在梗
死灶周围可见胶质细胞增生及周边散在的小血管芽
向坏死区生长并形成胶质瘢痕, 后期( 3—4 周)边缘
有明显的血管和成纤维细胞增生, 在梗死灶内有肉芽
和血管支架形成。 同时促使梗死区周边大量的细胞增
殖, 侧支循环改善, 并激活梗死灶周围和对侧相应皮
质神经元功能, 从而增加大脑的血液循环, 减少梗死
面积, 改善了脑缺血, 促进脑组织再生、 修复[7]
。 本实验
中康复组脑梗死大鼠在第 3 周出现了神经功能和运
动的明显改变, 而在 5 周时主要表现为运动功能的
改变。 研究发现脑损伤数周或数月后, 康复训练使一
些运动能力逐渐恢复, 主要是使传入神经不断刺激,
引起大脑产生功能重组[8]
。 有学者指出脑梗死致运动
皮质损伤后, 康复训练能使邻近的非损伤区发生功
能重组, 非损伤区在运动功能的恢复上发挥重要作
用[9]
。 康复训练也可促进大脑损伤区形成功能环路的
重建, 从而改善运动功能[ 10]
。有关运动训练促进脑学习记忆神经功能恢复的机制尚未清楚。 其机制可能是
通过多种途径的复合机制而发挥作用的。余茜等[ 11]
研
究发现运动训练可明显改善运动神经功能和学习记
忆能力, 使健侧海马突触界面曲率和突触后致密物
厚度增大以及穿孔性突触的百分率增多, 突触穿孔
后致密物变为节段, 出现多个活性区, 使得不同受体
簇的不同活性区传递功能大大加强, 进一步加强了
突触传递功能, 使其习得性长时程增强 ( long- term
potentiation, LTP)形成速度明显快于模型组。并指出
运动康复促进脑梗死大鼠学习记忆能力的恢复可能
是通过影响脑梗死鼠健侧海马 CA3 区 N- 甲基- D-
天冬氨酸(N- methyl- D- aspartate, NMDA) 受体通道
开放电导水平、 开放时间和开放概率来实现的。 康复
训练后健侧海马突触体游离钙离子浓度变化可影响
信息处理过程, *终表现在学习记忆能力行为上, 表
明运动训练改善脑缺血大鼠学习记忆与海马神经元
SCF( Ca)密切相关。Tischmeyer 等[12]
报道大鼠在完成
Y- 型迷宫视觉辨别任务后, 其海马 c- fos mRNA 升
高。在清醒大鼠海马齿状回诱导 LTP 可导致 c- fos
基因表达增高。
NF 是神经元特有的结构蛋白, 它特异性的分布于神经元的胞体及突起内, 在胞体内多交叉成网。
NF 形成细胞骨架并起维持作用, 此外在轴浆运输中, 对微管起协调作用。 它代表了神经元的功能和联
系。 研究也发现神经丝与多聚核糖体关系密切, 参与
蛋白质翻译过程。 在病理情况下(如损伤和缺血) , 神
经丝发生降解[13]
, 因此其表达水平能很好地反映神
经元的病理变化。Bidmon 等 [14]
研究发现磷酸化
NF200 阳性纤维主要为神经元轴突, 指出在脑缺血
早期, 脑梗死灶中央的阳性纤维明显减少, 提示神经
元轴突 NF200 蛋白质发生降解。NF200 蛋白质水平
变化与神经元的敏感性呈正相关, 其降解被认为是
钙敏感蛋白质作用的结果。研究发现 NF200 与钙敏
感蛋白质是缺血导致迟发性神经死亡连锁反应中的
重要环节。此外 NF200 与突触的超微结构相关, 其
变化也会影响到突触传递可塑性变化。
本实验中采用磷酸化 NF200 蛋白质作为神经
元轴突的标记物, 观察运动训练对脑缺血大鼠神经
功能、 运动能力、 学习记忆能力和 NF200 蛋白质表
达变化的影响, 探讨运动训练对**的形态和功能
的可塑性影响。 实验中发现在手术后 1 周, 模型组和
康复组的 NF200 阳性纤维较假手术组明显减少, 比应的行为学测试(神经功能和运动能力)也较假手术
组明显减退, 差异有显著性意义( P<0.01)。提示脑梗
死大鼠出现神经功能和运动能力的减低可能与
NF200 在脑缺血的情况下发生降解有关。在手术后
3 周康复组 NF200 阳性纤维数量明显增多, 纤维明
显增粗并扭曲, 染色加深, 呈辐射状, 由梗死灶周边
向梗死灶中央延伸。康复组 NF200 阳性纤维表达
(OD 值)较模型组明显增加, 其差异有显著性意义
( P<0.05) , 相应的行为学检测提示康复组神经功能
和运动能力明显优于模型组。 在手术后 5 周, 模型组
阳性纤维较前稍有增多, 仍较紊乱, 康复组 NF200
阳性纤维排列整齐, 染色均匀, 分布密集, 纹理清晰,
康复组 NF200 阳性表达 OD 值与模型组比较差异
有极显著性意义( P<0.01) , 其运动能力和学习记忆
能力明显优于模型组。在手术后 3 周和 5 周康复组
NF200 蛋白质表达增加提示运动训练促进神经元轴
突发芽和再生并有突触形成。目前已证实神经元轴
突的发芽和突触形成与动物的行为学恢复密切相
关。本实验中 NF200 蛋白质表达增加的同时有脑梗
死大鼠行为学的改善(包括了神经功能、 运动能力和
学习记忆能力的改善)。 以上结果表明运动训练能明
显改善脑缺血大鼠神经功能、运动能力和学习记忆
能力, 可能与运动训练促进神经元轴突的再生和发
芽机制有关。同时由于运动训练能增加神经元轴突
发生出芽和形成新的突触联系, 增加突触曲率及PSD含量, 导致突触结构的可塑性变化, 形成新的神
经回路, 促进神经元信息网络联络网的重建, 从而促
进脑梗死大鼠运动和学习记忆能力康复。
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