重组人胰岛素的制备—下游纯化工艺的研究

　 　摘要　建立了一套通过大肠杆菌表达(H is) 62 A rg2 A rg2人胰岛素原[ (H is) 62 A rg2 A rg2 human p ro insulin,
RRhP I]制备重组人胰岛素的工艺。将大肠杆菌中以包涵体形式表达的RRhP I依次经过DEA E2琼脂糖快流速阴离
子交换层析, Sephadex G225 层析, 重组复性酶切转化和 Superdex75 分子筛, 制备重组人胰岛素。SDS2 PA GE、
HPLC、氨基酸组成分析和小鼠惊厥实验结果证明, 制备的重组人胰岛素具有天然生物活性, 而且纯度较高。
关键词　重组人胰岛素　纯化　DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂　Superdex75
Prepara t ion of Recombinan t Human In sul in—Study of Down stream Proces
Yu Rong
1, 2
　L i Xiaohong
1
　Yang J iyu1
　WuWutong
2, $
1 (D ep artm ent of B iop harm aceu tics, W est Ch ina S chool of P harm acy , S ichuan U niversity , Cheng d u　610041, Ch ina)
2 (T he S chool of L if e S cience & T echnology , Ch ina P harm aceu tical U niversity , N anj ing　210009, Ch ina)
　　Abstract　Th is study w as intended to establish a method of p reparat ion of recombinant human insulin,w ith
(H is) 62 A rg2 A rg2 human p ro insulin (RRhP I ) exp ressed by Escher ich ia co li . A f ter DEA E2 Sepharo se Fast F low ion2
exchange ch romatography, Sephadex G225 ch romatography and refo lding, enzyme cleavage and Superdex 75 size
exclusion ch romatography, the RRhP I exp ressed by Escher ich ia co li in inclusion body fo rm w as conver ted to human
insulin . The obtained recombinant human insulin w as analyzed by SDS2 PA GE, HPLC, am ino acid compo sit ion
analysis and bio ident ity test (mouse convulsion test). The results indicate that our obtained p reparat ion is h igh ly
pureif ied, act ive recombinant human insulin .
Key words　Recombinant human insulin　　Pur if icat ion　　DEA E2 Sepharo se fast f low　　Superdex75
1　引　言
分离纯化是基因工程**生产中极其重要的一
环, 这是由于工程菌经过大规模培养后, 产生的有效
成分含量很低, 杂质含量却很高; 另外由于基因工程
**是从转化细胞, 而不是从正常细胞生产的, 因此
对产品的纯度要求也高于传统产品。所以要得到合
乎医用要求的基因工程**, 分离纯化要比传统产
品困难得多。在重组人胰岛素(Recom b inan t hum an
in su lin, rh I)的基因工程生产中, 同样面临着下游处
理非常复杂的问题。为了能有效地纯化目的产物, 目
前基因工程生产中普遍使用的是亲合层析和HPLC
等手段, 这些分离纯化技术虽然分辨率高, 特异性
强, 但十分昂贵。不利于降低成本。为了降低生产成
本, 本研究建立了一套由(H is) 62 A rg2 A rg2人胰岛素
原[ (H is) 62 A rg2 A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ]制
备重组人胰岛素的下游纯化工艺, 并对产品的性质
和纯度进行了鉴定。
　　RRhP Iö pQ E240 大肠杆菌M 15 菌株。
2 . 2　主要试剂
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂为杭州争
光树脂有限公司产品, Sephadex 为 Sigm a 公司产
品, Superdex75 为Am ersham 公司产品, 胰蛋白酶
和羧肽酶B 均为Sigm a 公司产品, 低分子量蛋白标
准为上海东风生物技术有限公司产品, 人胰岛素标
准品为Roche D iagno st ics Co rpo rat ion 产品, 谷胱
甘肽(氧化型和还原型)为上海博奥生物科技有限公
司产品,DTT 为O rgan ics Inc . 产品, 其它化学试剂
均为国产或进口飞行纯。
2 . 3　菌培养和RRhP I的表达
参照文献[1 ]。
2 . 4　包涵体的收集和洗涤
参照文献[1 ]。
2 . 5　RRhP I的初步纯化
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析柱用 302　材料与方法
2 . 1　工程菌
$ 联系人。E2 mail :wuw tong@mailbox . cpu . edu . cn
mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿素, pH8. 0 平衡, 包
涵体用 30 mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿素, 50
mmo lö L DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合适的氯化
钠梯度进行洗脱, SDS2 PA GE 确定RRhP I组分, 收
集含RRhP I的洗脱液。
2 . 6　复性及酶切转化
将初步纯化后的RRhP I在 Sephadex G225 层
析柱上脱尿素, 转换缓冲液进行重组复性, 然后用胰
蛋白酶和羧肽酶B 协同酶切将RRhP I转化为人胰
岛素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo lö L ZnCl2 终止反
应并沉淀h I。
2 . 7　h I的纯化
将h I粗品用 30 mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿
素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上进行分离纯化
层析柱的平衡液和洗脱液均为 0. 2 mo lö L 乙酸钠
乙酸, pH4. 0。
2 . 8　SDS-PAGE 分析
按文献[2 ]操作。
2 . 9　HPLC 分析在日本岛津HPLC 仪上, 用ODS C18 反相柱
(150mm×6. 0mm )进行分析, 流动相为0. 2mo lö L
(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo lö L H3PO 4 调pH 至 3. 5)和
50%乙腈水溶液按 1∶1 (vö v)混合而成, 流速 1. 0
m lö m in, 检测波长214 nm , 上样量 20 u l。
2 . 10　氨基酸组成分析
称样品 2. 5 m g, 加6 mo lö L HCl 2 m l, 110℃水
解24 h, 蒸干后加入2 m l无离子水溶解, 直接进样,
在日立 835250 型氨基酸分析仪上进行氨基酸组成
分析。
2 . 11　h I整体生物活性的鉴定
按 2000 版《中华人民共和国药典》的规定用小
白鼠惊厥法鉴定h I的整体活性。
3　结　果
3 . 1　RRhP I的初步纯化
层析图谱见图1, RRhP I主要集中在峰2。收集
峰2, 进行SDS2 PA GE 分析, 见图2。结果显示电泳
条带主要集中在 13 KD 附近, 峰 1 为穿透峰, 此峰
中含有p I高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白质, 而绝大部分p I低于RRhP I的蛋白质和核酸类杂质牢固
地结合在柱子上, 需要较高的盐浓度才能洗脱下来。
　　表 1 是 6 次层析的重复实验结果, 可以看出,
RRhP I的回收率较高, 稳定在 75%～ 80%左右。
表1　离子交换层析的RRhP I回收率峰2 主要为折叠趋于正确的单体RRhP I, 收集峰 2。
进行SDS2 PA GE 分析。结果(见图 2)显示, 收集的
RRhP I样品中高分子量杂蛋白的含量有所减少。峰
1 为高分子量杂蛋白和RRhP I的二聚体或多聚体
及折叠不完全或不正确的RRhP I。　　在收集的RRhP I单体组分中, 加入 2. 5 mmo lö
L 还原型谷胱甘肽和 0. 25 mmo lö L 氧化型谷胱甘
肽以控制2 SH 比例, 通过二硫键的交换形成稳定的
具有天然结构的RRhP I。在37℃条件下, 用胰蛋白
酶(1ö 500, 酶ö RRhP I底物)和羧肽酶B (1ö 1000, 酶
ö RRhP I底物) 协同酶切 30～ 40 m in, (H is) 62 A rg2
A rg 和C 肽被准确切除, RRhP I转化为 h I。SDS2
PA GE 结果表明, RRhP I 几乎被完全酶切转化为
h I, 主要电泳条带的位置从 13 KD 附近下移至与人
胰岛素标准品平行的位置, 见图2。
3 . 4　h I的纯化
用 0. 1 mo lö L ZnCl2 沉淀的 h I粗产品可通过
Superdex 75 进行纯层析图谱见图4, h I主要集中在
峰3。收集峰3 进行SDS2 PA GE 分析, 结果显示, 见
图 2, 所得h I组份在 SDS2 PA GE 分析中是均一的,
只有一条蛋白带。将峰3 组分透析, 浓缩并冻干, 即
可*终制得h I。
3 . 5　产品的性质鉴定
3 . 5 . 1　SDS2 PA GE 分析　结果(见图2)表明, 本研究得到的产品的分子量与h I标准品相同, 且纯度较高, 在SDS2 PA GE 中呈一条蛋白带。
3 . 5 . 2　HPLC 分析　本工艺制备的重组胰岛素制
品主峰的保留时间(27. 757 m in)与标准品 h I的保
留时间(27. 968 m in)基本一致, 而与猪3 . 5 . 3　氨基酸组成分析　分析结果见表 2, 该结果
表明本工艺制备的重组胰岛素样品的氨基酸组成与
h I基本一致。样品中不含M et, 与胰岛素原一起表
达的(H is) 62 A rg2 A rg 已被准确切除, 样品中只剩下
1 个A rg 和 2 个H is, 这表明RRhP I已被成功地转
化成了h I。
3 . 5 . 4　h I整体生物活性的鉴定　5 只昆明种清洁
级小白鼠(雄性20～ 24 g) , 按每20 g 体重皮下注射
h I样品1. 25 U , 注射后 2 h 内均出现降血糖阳性反
应,其中有4 只惊厥。随即腹腔注射1m l 5%葡萄糖
注射液, 惊厥现象消失。这表明本工艺制备的 h I样
品具有很好的降血糖活性。胰岛素的保4　讨　论
4 . 1　RRhP I的初步纯化床要求等优点。但是HPLC 具有对软硬件的要求较
高, 前期投入大, 纯化量有限等等缺点, 从而使生产
能力受到影响。本研究在*后纯化制备人胰岛素时
选用的是 Superdex 75 分子筛层析, 其具有机械强
度高, 稳定性好, 重现性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨
率高(13 000 p latesö m ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m lö
m in, 25℃) , 且可在低压下操作, pH 范围广(3～
12) , 分离范围广 (球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特异性
吸附小, 负载量大, 层析条件易控制等等优点, 是一
个非常理想的纯化基因工程产品的层析方法。用0.
2 mo lö L 乙酸钠2乙酸, pH4. 0 的缓冲液作平衡液和
洗脱液, 将 h I粗品经过 Superdex 75 柱层析后, 我
们得到了纯度较高的人胰岛素制品, SDS2 PA GE 分
析样品只有一条带。目前尚未见采用 Superdex 75
纯化基因工程产品的有关报道。
胰岛素是天然生物活性物质, 必须保持天然的
二级结构才能发挥降血糖的生物活性。小鼠惊厥实
验的阳性结果充分表明, 本研究所选择的层析条件
不但有效地纯化了表达产物, 而且有效地防止了目的具有天然活性的基因工程人胰岛素。
致谢: 本教研室研究生祁晖在研究工作中给予了大力的支持!
参 考 文 献
1 L i XH, Yu R, Zeng R, et al . Enhanced Exp ression of (H is) 62
A rg2 A rg2 human P ro insulin in Escherich ia co li . Pharmaceu
Bio tech, 2003; 10 (3) 144 [李晓红, 余　蓉, 曾　蓉等. (H is) 62
A rg2 A rg2人胰岛素原在大肠杆菌中的高效表达. **生物技
术, 2003; 10 (3)∶144 ]
2 Guo YJ. Techno logy of P ro tein Elect ropho resis . Science P ress,
1999∶123 [郭尧君, 蛋白质电泳技术. 北京: 科学出版社, 1999
∶123 ]
3 T ikhonov RV , Pechenov SE, Belacheu IA , et al . Recombinant
Human Insulin Ð. Iso lat ion of fusion p ro tein S2Sulfonate,
bio techno logical p recurso r of human insulin, f rom theBiomass of
t ransfo rmed Esderich ia co li cells . P ro Exp r Purif, 2001; 21∶1764 Jonasson P,N ilsson J , Samuelsson E, et al . Single2step t ryp sin
cleavage of a fusion p ro tein to obtain human insulin and its C
pep t ide . Eur J Biochem, 1996; 236∶656
5 Kemm ler W , Peterson JD, Steiner DF. Studies on the
conversion of p ro insulin to insulin . J Bio l Chem, 1971; 246∶
6787
6 Go lden J. Equilibrium binding assay and k inet ic characterizat ion
of Insulin A nt ibodies . D iabetes, 1978; 27∶653
7 N ilsson J , Jonasson P, Samuelsson E , et al . Integrated
p roduct ion of human insulin and its C2 pep t ide . J. Bio tech, 1996;
48∶241
8 L iu T, Geng XD. L iquid ch romatography in genet ic engineering .
Ch romatogr, 2000; 18 (1)∶30 [刘　彤, 耿信笃. 基因工程中的
液相色谱. 色谱, 2000; 18 (1)∶30 ]
(收稿: 2002210223　　修回: 2003206205)
4 Jonasson P,N ilsson J , Samuelsson E, et al . Single2step t ryp sin
标产物h I的失活变性, 本研究*终制备了纯度较高
为了快速准确地从大量的杂蛋白中捕获目标产
留时间(25. 437 m in)有明显差别。