荷瘤小鼠抑郁状态的研究（悬尾）
荷瘤小鼠抑郁状态的研究
悬尾实验tail-suspension test TST
摘要：目的 观察荷瘤小鼠大脑皮层和海马脑源性神经营养因子(BDNF)表达水平变化，初步探讨荷瘤应激引起抑郁的分子机制。方法 建立荷瘤小鼠模型；以不同荷瘤时间的悬尾实验 （tail-suspension test，TST）的反应作为抑郁行为学指标；采用半定量及实时定量PCR技术分别测定荷瘤12d后小鼠大脑皮层及海马BDNF水平。结果 荷瘤组小鼠在TST中的不动时间随肿瘤接种时间延长而逐渐增加，于荷瘤第12天显著降低。同时，荷瘤第12天的小鼠大脑皮层及海马BDNF水平也明显降低，氟西汀处理可增加海马BDNF的表达。结论 荷瘤应激可通过降低海马及大脑皮质BDNF水平诱发抑郁绝望状态。悬尾实验tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁状态的研究（悬尾）
关键词：荷瘤；抑郁；脑源性神经营养因子；氟西汀悬尾实验tail-suspension test TST
悬尾实验tail-suspension test TST悬尾实验tail-suspension test TST
悬尾实验tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁状态的研究（悬尾）
荷瘤小鼠抑郁状态的研究（悬尾）
The study on the development of depression in H22 tumor-bearingmice悬尾实验tail-suspension test TST
Abstract: Objective To explore the molecular mechanisms of depression development inH22 tumor-bearing mice. Methods Tail-suspension test (TST) wasobserved as the despair behavioral response in H22 tumor-bearingmice. The expression of BDNF in the cerebrum and hippocampus ofmice were determined by RT-PCR and real time quantitative RT-PCRrespectively. Results The immobility time in TST was increased asthe tumor developed, and it changed significantly at 12 days aftertumor implantation. In the mean time, the expression of BDNFdecreased significantly in H22 tumor-bearing mice. The decreasedexpression of BDNF in hippocampus could be antagonized byfluoxetine for 12 days of treatment. Conclusion Tumor burden might induce stress-relateddepressive state by down-regulating the expression ofBDNF.
Key words tumor-bearing；depression；BDNF;Fluoxetine悬尾实验tail-suspension test TST悬尾实验tail-suspension test TST
临床大量研究表明肿瘤患者的抑郁症发病率及严重程度远远高出一般人群，但缺乏关于肿瘤与抑郁之间关系的基础研究。关于抑郁的发病机制说法不一，目前较公认看法认为与应激及应激性**关系密切。Sterling和Eyer于1988年提出了"非稳态（allostasis）概念，McEwen等又于1993年详细描述了非稳态负荷(allostasis load), 即指机体偏离机体自身稳态的程度。非稳态负荷可使机体通过调整达到稳态。正是由于非稳态，自主神经系统、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和机体各系统不仅能对内源性和外源性应激源产生积极反应以保护机体,也会因慢性过度的或消极的反应而导致机体的紊乱和衰竭。研究还发现应激可以通过下调抑郁症患者大脑海马及大脑皮质神经营养因子如脑源性神经营养因子（brain-derived nuerotrophic factor, BDNF）水平致神经元损伤和萎缩、影响神经元再塑和神经发生、使海马体积改变[1]。CT、MRI检查结果也证实抑郁症患者均有不同程度的大脑皮质和海马容积减少。同时大量证据发现癌症患者及荷瘤动物血浆中应激**包括GCS, ACTH等均有不同程度的改变。因此，我们提出假设：肿瘤作为一机体的恶性刺激，是否可影响机体的应激反应，*终诱发抑郁状态。我们拟通过悬尾实验（tail-suspension test, TST）测定荷瘤小鼠不动时间来观察其抑郁状态，并通过PCR技术来测定其海马及大脑皮质中BDNF表达，从而从分子水平研究其抑郁状态发生的机制，初步阐明肿瘤与产生抑郁的关系。悬尾实验tail-suspension test TST
悬尾实验tail-suspension test TST
1 材料与方法悬尾实验tail-suspension test TST
悬尾实验tail-suspension test TST
1.1 试剂及动物：盐酸氟西汀（Fluoxetine）胶囊，由Eli lilly and companylimited生产，规格：20mg/每粒，批号：20040715。健康balb/c雄性小鼠，体重18+2g；雄性肝癌H22腹水瘤小鼠，均为上海斯莱克实验动物有限公司提供。悬尾实验tail-suspension test TST
1.2 动物分组及荷瘤模型的建立 随机将健康小鼠分为3组，正常对照组，荷瘤组及荷瘤氟西汀处理组。取腹水瘤的种鼠，处死后抽取腹水液，生理盐水稀释4倍配制成瘤细胞悬液，约1×107个/ml,0.2ml皮下接种于小鼠右腋下。荷瘤加氟西汀组小鼠每日用氟西汀20mg/kg灌胃一次。
1.3 悬尾实验 将小鼠倒置悬吊，在5分钟内计算小鼠静止的时间.
1.4 RT-PCR法测定大脑皮层组织BDNF的表达 小鼠处死后，取出海马组织，抽提RNA，逆转为cDNA。BDNF及beta-actin的引物序列分别为5’-TCATTGGTAACCTCGCTCAT-3’; 5’-CCGAACCTTCTGGTCCTC-3 和5’-ACAGGCATTGTGATGGACTC-3’;5’-TTGATGTCACGCACGATTT-3。
1.5 实时定量RT-PCR测定海马BDNF的表达 2-SYBR为PCR的绿色荧光标记，引物序列为5’-GAGTCTTTGGTGGTTTGTGA-3’及5’-GCTCGGGTAGTTCGCTTTA-3’。95°C持续15分钟，然后经历40个循环使cDNA扩增，每个循环包括15秒94°C高温变性、30秒56°C低温退火、30秒72°C延伸。悬尾实验tail-suspension test TST
1.6 统计学分析 计量资料均以均数±标准差表示（Mean±s），采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为显著性差异。悬尾实验tail-suspension test TST
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2 结果悬尾实验tail-suspension test TST
悬尾实验tail-suspension test TST
2.1 荷瘤对小鼠TST的不动时间的影响 TST是经典的抑郁行为学实验，小鼠为克服不正常体位而挣扎活动, 但活动一定时间后, 出现间隙性不动, 显示“失望”状态, 因此，小鼠的不动时间反映了其抑郁状态。在本实验中，分别在第0天、第6天、第8天以及第12天测定小鼠的不动时间，发现随着荷瘤时间的增长，小鼠的不动时间逐渐延长。而氟西汀连续处理12天可显著缩短荷瘤小鼠的不动时间（图1）。悬尾实验tail-suspension test TST
图1 荷瘤对小鼠TST不动时间的影响悬尾实验tail-suspension test TST
Fig 1. Effects ofH22 tumor implantation on the immobility time (s) in the TST ofmice (Mean±s, n=10) 悬尾实验tail-suspension test TST
**P<0.01 vs before tumor implantation；c P<0.01 vs 12days after tumor implantation
2.2 荷瘤对小鼠海马BDNF表达的影响 实时定量PCR结果表明海马组织中的BDNF表达下降，氟西汀处理12天后BDNF表达上调，与荷瘤模型组存在显著差异（表1，图2）。悬尾实验tail-suspension test TST
表1.荷瘤对小鼠海马BDNF表达的影响
Tab 1. BDNF level in the hippocampus of H22 tumor-bearing mice (Mean±s, n=5)
组别 | 对照组
| 荷瘤模型组
| 荷瘤氟西汀处理组 |
RNA相对浓度 | 0.96±0.05 | 0.34±0.10** | 0.58±0.15b |
**P<0.01 vs before tumor implantation；b P<0.05 vs 12days after tumor implantation
悬尾实验tail-suspension test TST
**
|
b |
图2 实时PCR技术测定小鼠海马BDNF水平
Fig 2. BDNF level in hippocampus byreal-time PCR (Mean±s, n=5)
**P<0.01 vs before tumor implantation；b P<0.05 vs 12days after tumor implantation
悬尾实验tail-suspension test TST
2.3 荷瘤对小鼠皮层<%3
