慢性应激对大鼠海马NGF、NT-3表达的影响
慢性应激对大鼠海马NGF、NT-3表达的影响及应激停止后的变化
摘要：目的 探讨慢性应激对大鼠海马神经元NGF、NT-3蛋白表达的影响及其应激停止后的变化。方法 采用慢性强迫游泳制作动物模型。运用open-field法观察大鼠行为学的变化，运用**组织化学方法观察大鼠海马DG区、CA3区NGF、NT-3的表达。结果与对照组相比,实验组1大鼠海马CA3、DG区NGF、NT-3的平均灰度值显著增加（p<0.05和p<0.01），实验组2平均灰度值与对照组2相比同样增加（p<0.05和p<0.05）。结论慢性应激使大鼠海马NGF、NT-3表达降低，应激三十天后，其表达仍低于对照组。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
关键词：慢性应激 海马 NGF、NT-3 强迫游泳porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
[中图分类号] R395 [文献标识码] A
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Effects of chronic stress on the expression of NGF、NT-3 in hippocampusof the rats porsolt swimtest强迫游泳实验系统 forced swim
Bi Bo, Jin Kuihe，Zhu Yuzhang, et al.
Department ofPsychiatry and Medical Psychology, The First Affiliated Hospital,China Medical University, Shenyang 110001
Abstract: Objective To observe the changes ofNGF、NT-3 expression inhippocampus of the rats with the forced－swimming and the changes of NGF、NT-3 after poststress. Methods The protocol was established with the forced－swimming as the chronic stress model. Open－field test was executed to measure the behaviors of the rats. Immunohistochemistry was used to observe the changes of NGF、NT-3 expression in the hippocampus. Results Compared to the control group，the expression of NGF、NT-3 in CA3 region of the hippocampus and dendate gyrus(DG)of the rats was decreased morphologically. With the computerized image analysis, the gray degree increased significantly and the changes showed the same results after the poststress. Conclusion Chronic stress decreased the expression of the NGF、NT-3 in CA3 region and DG in the hippocampus of the rats and the changes showed the same results after the poststress.
Key words: chronic stress,hippocampus, NGF、NT-3,forced－swimming,
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神经生长因子(neuron growth factor NGF)是**个被发现、也是生物学功能了解得*清楚的一个神经营养因子。NGF对皮质、海马、基底前脑的胆
碱能神经元有神经营养作用。[1]它和神经营养因子3(neurotrophin3, N T-3 )广泛地分布在海马、大脑皮层、中隔等**神经系统中,它们在神经保护、突触再生、神经损伤后功能重建等方面也发挥了重要作用。应激事件导致神经化学方面的改变可能参与了抑郁障碍的发生，此外，神经***、神经递质和神经可塑性的改变在抑郁障碍的发生中也起到十分重要的作用。[2] 本研究利用**组化的方法观察NGF、NT3在慢性应激以及应激过后在海马的表达变化，以了解NGF、NT3和抑郁障碍的关系。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
1 对象与方法porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
1.1实验动物porsolt swimtest强迫游泳实验系统 forced swim
成年Wistar雄性大鼠32只（由中国医科大学动物实验室提供），体重160－180g。将实验大鼠置于自然昼夜节律光照条件下，自由进食、饮水，每笼6-8只，控制室温于18～20℃。大鼠适应环境1周后，称重，并采用 Open-field（开场）实验测定行为，记录大鼠5min内的动作行为表现，包括中央格停留时间、水平穿越格数、竖立次数、修饰次数和粪便粒数。依体重和Open-field实验评分，将大鼠随机分为四组，每组8只，分别为对照组1、对照组2、实验组1和实验组2。各组间体重和Open-field实验评分均无显著性差异。对照组每笼喂养4只，实验组的大鼠于单笼喂养。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
1.2 实验方法porsolt swimtest强迫游泳实验系统 forced swim
将实验组1和实验组2的大鼠每天上午十点钟放入长宽50cm×60cm、水深25cm、水温恒定0℃的冰水玻璃缸中强迫游泳5min，每天给予刺激一次，共21天。对照组1与对照组2的大鼠放在笼中群养，不给任何刺激。第22天杀死对照组1和实验组1的大鼠, 实验组2停止强迫游泳和对照组2继续喂养，30天后，处死动物。各组大鼠在被处死前均采用 Open－field法测定大鼠的行为并称体重。处死方法：用****（50－60mg／kg）经腹腔麻醉，麻醉起效后将大鼠固定在灌流台上，剖开胸腔，经左心室快速灌注37ºC生理盐水（含适量肝素）150－200ml，继而灌注4%多聚甲醛溶液（用PBS配制，pH＝4）200－300ml，持续30－40min后，取脑组织并修块。将脑修块置于4％多聚甲醛溶液中固定48小时，梯度酒精脱水，石蜡包埋后，冠状切片,片厚约7µm。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
通过ABC**组化染色方法检测NGF、NT3蛋白的表达。切片经脱蜡、水化后入PBS（PH7.4），3%H2O210分钟内去除过氧化物酶，切片用微波进行抗原修复，然后进行**组织化学ABC法染色。用兔抗鼠NGF、NT3作为一抗，工作浓度为1：200。用生物素化的羊抗兔IgG作为二抗，工作浓度为1：200。*后加ABC复合物，工作浓度为1；100，*后加DAB显色液显色5-10分钟。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
每只大鼠取双侧海马CA3区DG区切片各两张，在计算机图像分析系统（Meta Morph／Ax70）上测量NGF、NT3平均光密度和平均目标灰度值(所测阳性细胞平均灰度),灰度单位分为256个等级,**反应的强弱与灰度值呈反比关系。
采用SPSS for Windows 10.0软件分析，数据以均数加减标准差(x-±s）表示,组间检验采用t检验,p值取0.05。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
2 结果porsolt swimtest强迫游泳实验系统 forced swim
开场行为评定：实验组与对照组的大鼠第21天的数据相比(表1)，慢性应激后实验组大鼠的体重增加减少（t=－4.07，P<0.01），中央格停留时间延长（t=2.42，P<0.05），水平穿越格数减少（t=－5.40，P<0.01），竖立次数减少（t=－5.70，P<0.05），修饰次数减少（t=－3.00，P<0.01），粪便粒数无明显差异（t=0.638，P>0.05）。应激后30天，实验组2与对照组2相比，大鼠的体重增加减少（t=－2.80，P<0.01），中央格停留时间延长（t=3.13，P<0.05），水平穿越格数减少（t＝3.89，P<0.01），竖立次数减少（t=－2.73，P<0.05），修饰次数减少（t=－2.54，P<0.05），粪便粒数无明显差异（t=0.527，P>0.05）。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
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表1 A组大鼠开场行为的比较
体重(g) 中央格时间(s) 水平穿越格数 竖立次数 修饰次数 粪便粒数
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对照组1 259.63±25.32 0.98±0.36 31.75 ±8.75 14.00±4.34 10.25±5.75 1.75±1.03
实验组1203.88±29.34** 3.05±2.40* 19.50±6.78** 4.37±1.99* 3.37±2.97** 1.37±1.30
对照组2 323.38±20.00 0.70±0.42 29.75±9.57 12.88±5.84 9.63 ±3.16 2.13±1.55
实验组2 295.50±19.79* 3.55±2.54* 15.37±4.21** 5.63±4.72* 6.13±2.30* 1.75±1.28 |
* *表示P<0.01 *表示P<0.05
实验组1大鼠海马CA3区DG区NGF、NT3阳性细胞与对照组1相比平均灰度值增加（P<0.05 和P<0.01）。实验组2大鼠海马CA3区DG区NGF、NT3阳性细胞与实验组2相比平均灰度值增加（ P<0.05和P<0.01）。
表2 慢性应激和应激后大鼠海马DG、CA3区NGF、NT3的表达
CA3区 DG区 porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim |
灰度值 灰度值 NGF NT3 NGF NT3
对照组1 182.45±0.37 164.56±0.21 179.24±0.54 154.28±0.77
实验组1 187.25±0.87* 169.67±0.94** 183.49±0.21* 157.33±0.39*
对照组2 181.85±1.02 163.23±0.63 180.34±0.98 156.65±0.58
实验组2 186.31±0.68* 170.30±1.22** 187.79±1.01** 162.79±0.98** |
* *表示P<0.01 *表示P<0.05 porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
3 讨论porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
本动物模型利用长期强迫游泳的中等强度应激造成分养动物抑郁状态。实验结果表明,与对照组相比,实验组大鼠的体重增加量明显减少, 中央格停留时间延长，水平穿越格数减少，竖立次数减少，修饰次数减少，粪便粒数无明显差异，提示慢性应激使大鼠出现抑郁样行为。停止慢性强迫游泳刺激30天以后，上述改变依然存在，显示应激停止后抑郁样行为持续存在。
慢性应激可以使海马CA3区神经元的树突发生持久的和不可逆的损伤，主要表现为树突长度的缩短、分支数量的减少和海马齿状回神经元的再生障碍。[3，4]不断有证据表明慢性应激是抑郁发生的一个很重要的因素，其所引起的海马结构和功能上的变化与抑郁障碍的发生密切相关。[5]许多神经影像学和尸检的研究提示抑郁障碍的发生与某些特定神经网络的神经可塑性损害相关。[6]例如，〕MRI的研究表明，抑郁障碍的病人前额叶、海马和纹状体区的灰质部分减少，这些变化很可能是由于神经元的凋亡和神经营养过程的失调所导致的。神经营养因子合成的缺乏（NGF、NT3 BDNF、Bcl-2）使海马和前额叶神经凋亡增加，这一改变很可能与抑郁障碍病人认知功能的损害相关。[7] porsolt swim test强迫游泳实验系统 forcedswim
NG是迄今发现的**对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子,NGF是一种多亚基蛋白组成的靶组织源性细胞因子,对神经组织的生存、发育、修复及神经功能的维护具有重要的作用。它是**神经系统中重要的生物活性物质之一,外源性NGF 能促进**神经****,维持其存活,减少病理性死亡。[8]神经营养因子3主要存在于海马的齿状回，在**神经元的再生，海马的可塑性和记忆等方面发挥重要的作用。[9]本研究的实验结果表明，慢性强迫游泳应激可以减少海马神经元神经营养因子NGF、NT3的表达，而且应激停止三十天后，此两种神经营养因子的表达仍然降低。由此可以推测慢性应激所致的抑郁障碍模型鼠的海马神经元的损伤和丢失可能与神经元的保护因子NGF、NG3的降低有关，而且此种改变在不给予任何**手段的情况下是不可逆的。,研究抑郁障碍与NGF、NT3的关系将不仅为我们理解该**病因病理学机制、同时为研究和开发NGF、NT3这样的新型抗抑郁**提供一个崭新的途径。porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
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参考文献porsolt swim test强迫游泳实验系统 forced swim
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