側腦室注射1922IgG2saporin致癡呆動物模型的實驗研究

材料與方法

1. 　材料

乙酰膽堿轉移酶(ChAT)單克隆抗體購自Chemicon公司, Ultrasensitive SP試劑盒、DAB顯色

試劑盒均為MaxinBiotech Inc. 公司產品。成年雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠24隻,體重250～300g,隨機分為: (1)正常組(n=8); (2)生理鹽水組(n =8):左側側腦室注射生理鹽水溶液5

μl; (3)模型組(n=8):左側側腦室注射1922IgG2sa2porin溶液2. 5μg/ 5μl。

2.動物模型製作

模型組大鼠用1%****鈉(40mg/kg)行腹腔注射,動物麻醉後采用平頭顱位固定於立體定

位儀上。全部器械以1%新潔而滅溶液浸泡過夜(加1%亞硝酸鈉防鏽)。依次用3%碘酒、75%酒精**。沿顱頂正中矢狀位切開頭皮,刮除骨膜,用3%H2O2 燒灼。使顱骨發白,用**棉簽充分推開傷口,參照大鼠立體定位圖譜,以前囟為零點,按前囟後0. 8mm,外側1. 5mm坐標用7號針頭把顱骨鑽一孔,用10μl微量進樣器取1922IgG2saporin2. 5μg/ 5μl,從該孔垂直進針,針深至腹側5. 5mm,緩慢勻速推注,時間不少於5min,再留針3min。傷口**,縫合皮膚。生理鹽水組用同樣的方法注射5μl的生理鹽水。飼養3周後,進行Y迷宮行為檢測。4周後處死大鼠,采用**組化結合圖像分析技術觀察各組大鼠基底前腦ChAT陽性神經元數目的變化。

3. 　Y迷宮行為檢測

3周後,各組大鼠在三等份輻射式迷宮箱中進行檢測,箱的每支臂頂端裝有信號燈,燈亮區為**區,**區的方位隨機變換。選用電壓70V電擊延時30s。訓練大鼠學會分辨**信號燈而主動逃避電擊。在條件性回避反應建立後,每天分上、下午各給大鼠10次測試,連續訓練6d,其間10次測試中有9次以上正確為學會標準。記錄每隻大鼠達到學會標準所需訓練次數為學習能力(次數越少,表示學習能力越強,反之越弱);到達學會標準24h後再進行一輪測試,正確次數為記憶能力(次數多,表示記憶力強,反之弱)。

4. 　組織切片製作及染色

麻醉動物,經左心室2升主動脈快速連續灌注200ml生理鹽水,至肝臟顏色變白後再灌注4%多聚甲醛溶液250ml(0. 1mol/LPB配製, pH7. 4),按先快後慢的原則, 60min內灌注完畢。迅速開顱取腦,置於4℃的同樣固定液中後固定約2～4h,然後將腦組織移入15%的蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配製, pH7. 4)中置4℃冰箱過夜,再入30%蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配製, pH7. 4)4℃過夜。腦組織用恒冷箱切片機作冠狀連續切片,片厚40μm,用PBS收集切片。切片始於胼胝體交叉的起始水平,止於前連合交叉前緣,每隔3片取2片,按ABC法進行**組化染色。切片首先用0. 01mol/L的PBS(pH7. 2)洗5min×3次;每張切片加一滴過氧化物酶阻斷劑處理30min, PBS洗5min×3次;進而加一滴正常非**動物血清處理30min;吸乾試劑後,每張切片再加50μl ChAT單克隆抗體溶液(1∶800),於4℃冰箱孵育過夜。此日用PBS洗5min×3次;依據上述方法,按順序分彆加生物素標記的二抗和鏈黴素***蛋白-過氧化酶,*後每張切片加新鮮配製的DAB顯色液(850ml雙蒸水加DAB試劑盒A、B、C各1滴)50μl顯色3～6min,鏡下觀察顯色滿意以後用PBS漂洗,貼片,涼乾後梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

5. 　電腦采圖及計數

每隻大鼠選取隔2斜角帶複合體5個代表平麵,每個平麵在低倍鏡(4 ×)下選擇一側內側隔核

(MS)和斜角帶垂直部(VDB)觀察視野,再於中倍鏡(20×)下以2個視野包括MS和VDB細胞密集區,使用全自動圖像分析係統(德國KONTRONIBAS2. 0,JVCky2F30B32CCD彩**像攝錄輸入儀)顯示視野,通過圖像分析處理,對陽性神經元的數目、麵積和周長進行定量檢測;高倍鏡下(40×)觀察神經元形態。

6. 　統計學方法

所有實驗數據均為計量資料,用均數±標準差(€x±s)表示。用SPSS11. 0統計軟件進行統計學分析,各組資料的比較采用t檢驗,兩變量的相關性采用直線相關回歸分析。

結　　果

1. 　各組大鼠學習記憶能力的比較Y迷宮檢測各組大鼠學習、記憶能力的結果見表.經配對t檢驗顯示:模型組大鼠的學習、記憶能力明顯下降,與正常組和生理鹽水組比較均有顯

著性差異(P<0. 01)。