REM睡眠剝奪與恢複睡眠對大鼠學習記憶能力及皮質nNOS**陽性細胞數目的影響

【摘要】　目的　探討快速眼動(REM)睡眠剝奪及恢複睡眠和**乾預對大鼠學習記憶能力及皮質神經元型一氧化氮合酶

( nNOS)**陽性細胞數目的影響。方法　80隻SD大鼠,隨機分為睡眠剝奪組( SD) 、空白對照組(CC) 、環境對照組( TC) 。其中

睡眠剝奪組包括睡眠剝奪1、3、5、7 d,恢複睡眠6、12、24和48 h 8個時點。用改良多平台睡眠剝奪法進行REM睡眠剝奪,利用Y

迷宮測定大鼠學習記憶能力、運用**組織化學觀測神經元型一氧化氮合酶陽性細胞表達變化。結果　同空白對照組及環境對照

組比較,所有睡眠剝奪組大鼠學習記憶能力均下降,而睡眠剝奪時間越長,學習記憶能力下降越明顯,皮質nNOS陽性細胞數目越

多。隨睡眠恢複時間延長, nNOS陽性細胞數目逐漸減少,學習記憶能力提高。結論　REM睡眠剝奪能夠導致學習記憶能力下降,

其機製與一氧化氮合酶增高分解產生的一氧化氮增多對神經的毒性作用有關。

[關鍵詞] 　睡眠剝奪;睡眠;記憶;一氧化氮合酶

　睡眠剝奪是指由於某些原因導致的睡眠數量減

少或睡眠質量下降。睡眠剝奪對人體的影響十分明

顯:睡眠剝奪可以引起軀體疲勞、作業能力降低、**

功能下降、警覺水平降低,並引起情緒改變,精神不振、

粗心、注意力不能集中、食欲下降、記憶力下降、工作效

率降低等**反應。長時間睡眠剝奪可引起實驗動物

死亡。本研究REM睡眠剝奪對大鼠學習記憶能力的

影響, 研究與學習記憶密切相關的一氧化氮合酶

(NOS)在REM睡眠剝奪不同時點的變化,同時通過迷

宮試驗測量不同時點睡眠剝奪後學習記憶能力的改1　材料與方法

1·1 　實驗動物　成年雄性Sp rague2Dawley大鼠80

隻,重250～300 g,清潔級。由上海**醫科大學實驗

動物研究中心提供。

1·2 　實驗儀器　MG2Ⅱ型迷宮、H86 漩渦混合器、

TGL18台式高速冷凍離心機、MP120電子天平、LXJ2Ⅱ

離心沉澱機、玻璃勻漿器、電熱恒溫水浴箱、Leitzl400

切片機、HP IAS21000圖像測量分析係統等。

1·3　**與試劑　Rabbit Anti2NOS1、即用型SABC

**組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒(博士德生物

工程有限公司) 。

中國醫師雜誌 　2007年 1月 　第 9卷第 1期 1

3 基1·4　動物分組及喂養　本實驗於2002年8月在長

征醫院神經內科實驗室進行。先將大鼠進行“Y”迷

宮[ 1, 2 ]訓練4～7 d,取達到標準(具體標準見後)的大

鼠,將大鼠隨機分為2組,分彆為睡眠剝奪組( SD組,

n = 40)和對照組( n = 40) 。睡眠剝奪組包括睡眠剝

奪1、3、5、7 d、睡眠剝奪7 d後恢複睡眠6、12、24、48 h

八個時點,每個時點5隻大鼠。分彆編號、稱重,對照

組分為空白對照組(CC, n = 20)和環境對照組( TC, n

= 20) 。

1·5　睡眠剝奪模型的建立　采用改良多平台睡眠剝

奪法(MMPM)建立REM睡眠剝奪模型。製作長110cm、寬60 cm、高40 cm的水槽,其中放置15個直徑為

615 cm,高810 cm的平台,平台間間隔15 cm,在平台

周邊注滿水,水溫保持在22℃左右,水麵距平台麵約

110 cm,大鼠在平台上可自行飲食飲水,並可在平台間

活動。當大鼠進入REM睡眠時,由於全身肌肉張力降

低,節律性地垂頭觸水而覺醒,從而使動物始終不能進

入REM睡眠。實驗在神經內科動物睡眠研究實驗室

進行,室內溫度控製在2210～2410℃, 40 W日光燈照

射08: 30～20: 30。實驗前將各組大鼠放在同1籠中飼

養2周,實驗前1周將大鼠放在平台上適應,每天適應

1 h。睡眠剝奪從08: 00開始,睡眠剝奪期間燈光持續

照射,水糟中的水每天更換。TC組采用與SD組大小

一樣的鼠箱,但在其底部並不放置平台,而是放置一麵

細密鐵絲網,把大鼠放在網上,網下置水至離網格1

cm,以形成與SD組相似的環境。其它條件均與SD組

相同。CC組為放在一起飼養2周,未進行任何處理的

大鼠,飼養條件與SD組、TC組均相同。1·6　取材　各組動物在相應時點處死,用於**組

化的實驗動物先予以10%水合氯醛( 30 mg/kg)腹腔

內注射麻醉,開胸經左心室至升主動脈插管,先以100

ml生理鹽水衝洗血液,隨後用冷的(4℃)含4%多聚甲

醛的011 mol/L磷酸鹽緩衝液( PB, pH 714)先快後慢

灌流固定。2 h後取腦置於30%蔗糖中。

1·7　認知功能測試　⑴MG22型“Y”迷宮設置參數

電刺激參數是:電壓50～70 V,延時2～5 s。⑵測試指

標　正誤判定的標準:大鼠在足底通電後10 s內一次

性跑向**區為正確反應,否則為錯誤反應,向所在的

起步區逆向逃竄也應歸為“錯誤反應”; 錯誤次數

(EN) :係每天訓練中出現錯誤反應的次數,一般訓練

20次/d,該指標反映大鼠反應的正確程度;全天總反

應時間( TRT) :動物的反應時間(潛伏期)指從信號燈

亮開始至大鼠第1次逃至燈亮區為止所耗的時間,全

天總反應時是一個實驗日(全天)完成所有反應(包括正確反應和錯誤反應)所需時間,該指標反映大鼠反應

時間的長短,可綜合評價大鼠的學習記憶能力。⑶訓

練方法　采用隨機休息法,**區以無規則次序變換,

以訓練大鼠辨彆燈光刺激及**方位的能力。以大鼠

所在支臂就作為測試的起點,大鼠受電擊後逃到**

區後,燈光繼續作用10～15 s,熄燈後結束一次測試,

兩次測試時間間隔為30 s或休息1 min後、再予以第2

次測試,依次重複。固定訓練20次/d,連續訓練3～4

d。⑷認知功能障礙的標準及計算　規定大鼠受電擊

後從起步區直接逃至**區為“正確反應”,大鼠學習

記憶成績以其測試達到連續10次中有9次(9 /10)正

確反應時所需的電擊次數表示。達9 /10正確反應標

準所需電擊次數多少表示大鼠認知功能的優劣。

1·8　**組化染色　運用ABC法,蘇木素輕度複

染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。

1·9　定量分析計數　分彆選擇3個相鄰視野,在40

倍光鏡下采用標準網格對**反應陽性產物進行計

數,以“個/mm2 ”為單位,取3個視野的平均值。以陽

性細胞數除以相應的麵積,得出陽性反應細胞的麵積

密度(NA) ,每個標本取3張切片的均值供分析。

1·10　統計學處理　用SPSS軟件,計數資料用.x ±s表示,差異顯著性檢驗用t檢驗分析。

2　結果

2·1　睡眠剝奪後大鼠行為和生理變化[ 3 ] 　睡眠剝奪

7 d行為的變化尤其明顯,表現為大鼠興奮性提高,探

究行為和攻擊性增強,對環境刺激的警覺性、反應性及

進攻行為也增強。睡眠剝奪7d生理改變明顯,大鼠飲

食量增加、能量消耗增加、體重下降。表現疲憊不堪、

皮毛蓬亂、無光澤,尾巴和爪子的底表麵也有損害。在

預實驗中觀察到睡眠剝奪7 d以後有個彆大鼠死亡。

睡眠剝奪7 d後恢複睡眠12 h上述表現大多消失,所

有大鼠均出現睡眠增加。

2·2　學習記憶測定　睡眠剝奪前各組學習記憶能力

基本一致( P > 0105) 。正常對照組和環境對照組自

始至終均未出現學習記憶障礙,而睡眠剝奪組隨剝奪

時間的增加,所需電擊次數較對照組明顯增加( P <

0101) ,出現學習記憶障礙,隨睡眠剝奪後恢複時間延

長,學習記憶能力提高。見表1。2·3　**組化染色　各組切片經nNOS**組織化

學染色後, nNOS**陽性細胞呈棕黃色。與對照組比

較, REM睡眠剝奪組大鼠皮質nNOS**陽性細胞均

明顯增多,各組皮質nNOS陽性細胞的NA。REM睡眠

剝奪組的NA顯著高於環境對照組和空白對照組( P

< 0101)見表1。表1　大鼠Y型迷宮學習記憶成績及皮質nNOS**

陽性細胞NA值　　( .x ±s )

　組彆例數電擊次數　　皮質NA值　　

　空白對照組20 　　12. 65 ±2. 37 　　　25. 6 ±4. 5

　環境對照組20 　　12. 67 ±2. 17 　　　28. 5 ±3. 4

　睡眠剝奪1d 5 　　20. 15 ±4. 10 　　　39. 6 ±2. 8▲

　睡眠剝奪3d 5 　　29. 68 ±5. 34▲ 　　　45. 7 ±3. 2▲

　睡眠剝奪5d 5 　　49. 31 ±5. 23▲▲ 　　　54. 3 ±1. 8▲▲

　睡眠剝奪7d 5 　　56. 67 ±4. 66▲▲ 　　　57. 9 ±3. 6▲▲

　睡眠剝奪恢複6h 5 　　45. 88 ±6. 47▲ 　　　53. 2 ±3. 8▲▲

　睡眠剝奪恢複12h 5 　　36. 53 ±3. 18▲ 　　　45. 4 ±4. 1

　睡眠剝奪恢複24h 5 　　20. 85 ±6. 44 　　　32. 3 ±3. 6

　睡眠剝奪恢複48h 5 　　18. 57 ±3. 20 　　　25. 1 ±2. 3

　　注:與對照組比較▲P < 0105; ▲▲P < 0101

3　討論

睡眠是機體的正常生理需要,睡眠一旦被剝奪,則

會對機體產生相應的生理和心理影響,並會導致行為

失常以及**的發生。睡眠能增強大鼠的學習能力,

對於學習複雜事物的鞏固化也是非常必要的。睡眠

時,一種細胞激活素的基因在大腦中活性提高,能改善

突觸傳遞,增強對獲取的信息進行處理和加工、形成記

憶的能力。研究發現,在整個睡眠階段中, REM睡眠

對學習和記憶的影響更大[ 4 ] 。在學習較複雜的知識或

完成較多的任務後, REM睡眠數量增加比較明顯;而

在完成簡單任務或學習簡單知識後, REM睡眠數量增

加並不多。探索學習記憶的原理與規律可以闡明以學

習記憶障礙為表現的睡眠障礙的機製和尋找其有效防

治的手段[ 5 ] 。一氧化氮(NO)作為**神經係統細胞間信使分子[ 6 ] , 在學習記憶機製中具有重要作用。

NOS是催化產生內源性NO的**酶類,NO作為神經

係統全新的信號物質,以其獨特的逆行信使作用參與

了與突觸可塑性及學習記憶有關的長時程增強(LTP)

機製[ 7, 8 ] 。NOS抑製劑可以阻斷LTP,表明NO為LTP

形成所必需。現已明確NO作為逆行信使介導LTP的

通路和機製。NO在突觸後產生並彌散出神經元,逆向

運行至突觸前以及周圍相關神經元,透過細胞膜活化

鳥氨酸環化酶,使cGMP水平升高,促進神經遞質(如

穀氨酸等) 釋放, 穀氨酸作用於突觸後NMDA 及非

NMDA受體,鈣離子內流流入突觸後,與鈣鎂一起激活

NOS,又產生NO,從而誘導和維持LTP過程。NO是近

年來被認識的一種特殊神經遞質,它既是學習記憶過

程的關鍵信號,又能產生嚴重的神經損傷。NO與海馬

長時程增強的形成有關[ 9 ] 。NO是由L2精氨酸和分子

氧在3種不同的一氧化氮合酶催化下生成的。根據酶的細胞或組織來源不同,將其分為3型:神經元型NOS

( nNOS,NOS21) 、**型NOS ( iNOS, NOS22)和內皮細

胞型NOS ( ecNOS, NOS23 ) ,從功能上講, nNOS和ec2

NOS屬於原生型( cNOS) , iNOS屬於誘導型( iNOS) 。

目前公認, ecNOS 產生的NO 有神經保護作用, 而

nNOS和iNOS產生的NO則有神經毒性作用。

本實驗發現,同對照組比較,所有睡眠剝奪大鼠學

習成績均下降,隨睡眠剝奪時間越長,大鼠學習能力下

降越明顯。睡眠剝奪時間延長,導致神經元型一氧化

氮陽性細胞數明顯增多,催化產生高濃度的NO,高濃

度NO具神經毒性作用表現在它能誘發氧化應激,抑

製線粒體功能,乾擾能量代謝,損傷DNA或導致DNA

突變,使胞液Ca2 +升高,激活大量途徑損害細胞,誘導

細胞凋亡[ 10 ] 。過高的NOS也具有神經毒性作用。本

實驗表明,睡眠剝奪組與睡眠剝奪後恢複睡眠組比較,

睡眠恢複可以改善學習記憶能力,減少電擊次數,降低

神經元型一氧化氮合酶陽性細胞數。證明及時恢複睡

眠可以防止睡眠剝奪後的學習記憶損害,其機製可能

與改善細胞內的代謝紊亂,從而改善學習記憶障礙。

本實驗也顯示,睡眠恢複並不能完全抑製睡眠剝奪所

致的神經元性一氧化氮合酶陽性細胞增多和阻止LTP

損害,說明睡眠剝奪後的學習記憶障礙的機製十分複

雜,並不是單一機製發揮作用。對於睡眠剝奪對學習

記憶及腦神經功能的研究有待於進一步深入。