瑞香狼毒提取抗實驗性癲癇篩選研究

【摘　要】　目的　對瑞香狼毒六種提取物(依次為瑞香狼毒水、生離物、丙酮、石油醚、乙迷、乙醇提取物)進行藥效學及毒性比較研究, 篩選出一種高效低毒的抗癲癇化合物, 便於臨床前機製探討。方法　采用動物三種驚厥模型, 測定瑞香狼毒六種提取物抗實驗性癲癇半數有效量(ED50)。計算其半數致死量(LD50)。結果　瑞香狼毒提取物Ë～ Î , 即丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四種提取物對小鼠*大電休克發作實驗(M ES)、戊四唑驚厥實驗(M ET)和電刺激大鼠皮層驚厥閾值(TL S)模型均具有較強的對抗作用。而其中丙酮提取物毒性較低, **指數高達 1419。結論　瑞香狼毒丙酮提取物是一種抗驚厥作用較強而毒性小的有希望的抗癲癇化合物。

【關鍵詞】　癲癇，瑞香狼毒，提取物，篩選

自發現狼毒大戟堿性提取液具有較強的抗驚厥、抗癲癇作用以來, 又進一步對瑞香狼毒(Stellera cham aejasm e L. , 為瑞香科植物; 藥用其根 radix stellerae)進行了大量基礎研究, 發現瑞香狼毒具有更強的抗驚厥、抗癲癇活性, 但迄今為止,尚未見抗驚厥、抗癲癇方麵的報道。本文通過瑞香狼毒六種提取物抗實驗性癲癇作用半數有效量(ED50)及測定其半數致死量(LD50) , 篩選出高效低毒化合物丙酮提取物, 便於進一步臨床前機製研究。

1　材　　料

111　動物: 昆明種小鼠 660 隻, 6～ 8 周齡, 體重(22±4) g,雌雄皆用。雌性大鼠72 隻, 3～ 4 個月齡, 體重(180±20) g,皆由本校實驗動物中心提供。

112　藥品及配製: 瑞香狼毒水、生離物、丙酮、石油醚、乙迷、乙醇六種提取物(提取物: É～ Î )均由沈陽藥科大學提供。實驗前水提物、生離物、丙酮提取物用蒸餾水配製; 石油醚、乙迷、乙醇提取物用蒸餾水加 2%吐溫 013 mL 配成不同濃度混懸液。戊四唑(met razo l)由荷蘭癲癇研究中心惠購, 實驗前用蒸餾水配成所需濃度。

113　儀器: *大電休克驚厥實驗用電驚厥儀; 電刺激大鼠皮層驚厥閾值測定采

用驚厥閾值自動測定儀。

2　方　　法

211　抗實驗性癲癇作用

21111　*大電休克驚厥實驗(maximal elect ro shock seiz2ure test,M ES) : 采用Sw inyard 法稍加改良。用兩個耳電極夾住動物兩耳尖部, 然後通以 8 Hz, 110 V 交流電刺激 013s, 以後肢強直與否為觀察指標[1 ]。實驗前 24 h 篩選動物,凡刺激未見後肢強直或反應不明顯小鼠棄之不用。將合格小鼠分為 5 組, 每組 10 隻, 分彆腹腔注射不同劑量同一待測提取物混懸液, 2 h 後測定其抗M ES 效應, 以B liss 法計算瑞香狼毒六種提取物抗M ES ED50值及 95%可信限。

21112　戊四唑驚厥實驗(met razo l seizure test,M ET ) : 將合格小鼠分為 6 組, 每組 10 隻, 其中 5 組分彆腹腔注射不同劑量同一待測提取物混懸液, 正常對照組腹腔注射等容量蒸餾水加2%吐溫, 2 h 後腹腔注射戊四唑100 mgö kg, 以待測提取物能否防止戊四唑引起的全身陣攣性驚厥為指標, 觀察5m in。正常對照組小鼠注射戊四唑後50 s 內全部出現陣攣性驚厥。計算六種提取物抗M ET ED50及95%可信限。

21113　電刺激大鼠皮層驚厥閾值測定 ( th resho ld fo rlocalized seizure, TL S) : 將實驗大鼠烏拉糖5 mLö kg 腹腔注射麻醉後固定於動物腦立體定位儀上, 施行無菌手術。按照Vo skuyl 等[2 ]實驗方法, 將兩根直徑112 mm 不鏽鋼電極植入腦兩側額葉皮層運動區, 牙托水泥固定。術後1 周采用電刺激驚厥閾值自動測定儀測定大鼠驚厥閾值。刺激參數: 單向斜坡梯形雙極脈衝; 波寬2 m s; 強度15 s 內從0～ 1 000 L A , 每日定時刺激2 次, 使大鼠出現前肢痙攣或麵部顫動和半側軀體痙攣時立即停止刺激, 以此刺激強度(L A )為驚厥閾值。連續刺激1 周, 驚厥閾值穩定後用於實驗。實驗分3 組, 每組6隻, 均刺激3 次, 取其均值為藥前驚厥閾值。之後分彆腹腔注射不同劑量(原生藥劑量相同)同一待測提取物Ë～ Î 混懸液, 藥後2 h 按藥前相同參數刺激, 記錄其升高閾值。

212　LD50測定

將健康小鼠分 5 組, 每組 10 隻, 腹腔注射不同劑量同一待測提取物混懸液, 觀察 24 h 小鼠死亡數。B liss法計算瑞香狼毒提取物Ë～ Î LD50。

213　統計學方法

結果用x q±s 表示, 實驗數據采用u 檢驗、析因分析。

3　結　　果

311　抗M ES 效應(ED50) : 見表1。瑞香狼毒六種提取物中丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四種提取物均能有效對抗小鼠M ES, 且對M ES 具有劑量依賴性對抗作用。

312　抗M ET 效應(ED50) : 見表1。瑞香狼毒六種提取物中丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四種提取物對M ET 亦有不同程度的對抗作用, 且對M ET 具有劑量依賴性作用。

313　抗 TL S 效應: 提取物Ë , 劑量為 60、 90、 120 mg 的升高閾值分彆為 141±49、 256±83、 305±81; 提取物Ì , 劑量為 500、 750、 1 000 mg 的升高閾值分彆為 141±49、 198±70、 244±62; 提取物Í , 劑量為 160、 240、 320 mg 的升高閾值分彆為 168±79、 305±90、 277±119; 提取物Π, 劑量為400、 600、 800 mg 的升高閾值分彆為152±45、 136±89、 261±94。四種提取物的中劑量組與低劑量組比較P < 0101, 高劑量組與低劑量組比較P < 01001。四種提取物亦能提高大鼠TL S, 且同一提取物呈量2效正相關。

314　LD50測定: 見表1。四種提取物中, 丙酮提取物毒性較低, 其LD50與石油醚、乙迷、乙醇提取物相比差異有統計學意義(P < 0101) , **指數高達 1419。

4　討　　論

本實驗**發現瑞香狼毒具有抗癲癇活性。藥效學實驗結果表明, 瑞香狼毒六種提取物中, 丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四種提取物均能有效對抗小鼠*大電休克驚厥發作, 對戊四唑驚厥亦有不同程度的對抗作用。四種提取物亦能提高電刺激大鼠皮層運動區誘發驚厥的驚厥閾值, 且同一提取物呈量2效正相關, 進一步肯定了其抗驚厥作用。毒性試驗(表 1)顯示了四種提取物中, 丙酮提取物毒性較低, 其LD50與石油醚、乙迷、乙醇提取物相比差異有統計學意義(P < 0101)。**指數高達1419。

以上結果充分表明, 瑞香狼毒為一有希望前途的***, 有望通過高科技手段對該藥有效抗癲癇成分丙酮提取物進一步分離提取, 分析其化學結構, 為定向半合成抗癲癇新藥奠定物質基礎和提供理論依據。