文章詳情
紫河車對阿爾茨海默病模型大鼠腦組織內β澱粉樣蛋白
日期：2025-05-06 23:32
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摘要：
【摘要 】 目的 觀察用紫河車乾預後的阿爾茨海默病 (AD)模型大鼠的腦組織內β樣澱粉蛋白 (Aβ)、 β類澱粉前體蛋白信使
核糖核酸 (βAPPmRNA)表達改變 ,探討紫河車改善阿爾茨海默病模型大鼠症狀的部分機製。方法 用 Okadaic acid (OA)注於實驗
大鼠腦內杏仁核建立 AD動物模型 ,用避暗法和穿梭箱法測試實驗大鼠的學習記憶能力 ,用**組織化學方法顯示實驗大鼠腦組織
內 Aβ表達的變化 ,用原位雜交方法顯示實驗大鼠腦組織內βAPPmRNA表達的變化。結果 用紫河車**和預防一段時間後的
AD模型大鼠 ,其學習記憶能力的測試成績明顯優於同時間點模型組大鼠的成績 ( P < 0105) ,其腦組織內 Aβ、 βAPPmRNA表達數
量也明顯少於同時間點模型組大鼠腦組織內的 Aβ、 βAPPmRNA表達數量 ( P < 0105)。結論 經紫河車乾預後 ,AD模型大鼠的行
為異常得到改善 ,同時其腦組織內 Aβ、 βAPPmRNA表達也受到抑製。
[關鍵詞 ] 阿爾茨海默病;紫河車;澱粉樣β蛋白;澱粉樣β蛋白前體
Effect of Ziheche onβ2 amylo id,β2 amylo id precursor prote i n mRNA i n bra i n tissue of ra tmodel of Alzhe i mer’ s d isea se
YUAN M eng2 sh i , CHEN X iang2liang, ZHOU De2 sheng, YANG Q i2 dong . First Affiliated Hos p ital of Hunan University of TCM, Changsha
410007, China
【Abstract】 Objecti ve To observe the changes ofβ2 Amyl oid,β2 Amyl oid p recurs or p r otein mRNA in brain tissue of rat model of
Alzhei mer’ sDisease (AD) after interventi on with Ziheche and investigate the mechanis ms of enhancing learning and memory in ratmodel of
Alzhei mer’ sDisease by Ziheche . Methods The rat model of Alzhei mer’ s diseases was established by stereotaxic injecti on of okadaic acid
(OA) t o one of amygdala comp lexes . The learning and memory ability of the rats was evaluated . The i mmunohist ochemistry was used t o i2
dentify the alterati ons ofβAmyl oid in brain tissue, and the in situs hybridizati on was used t o identify the alterati ons ofβAPP mRNA in brain
tissue . Results After the ratmodel of Alzhei mer disease were treated and p revented with Ziheche, their learning and memory ability was
better than those in ratmodel ofAD without treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) , the exp ressi on ofβAmyl oid, βAPP mRNA in
brain tissue was less than that not treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) . Conclusi on After treated and p revented with Ziheche,
the learning and memory ability of the ratmodel ofAD was enhanced, and the exp ressi on of theβAmyl oid,βAPP mRNA in brain tissue of
the ratmodel ofAD decreased .
【Key words】 Alzhei mer disease; Placenta hominis ;Amyl oid beta2 p r otein;Amyl oid beta2 p r otein p recurs or
從臨床實踐中表明阿爾茨海默病 (AD) 無論從
發病機製還是臨床表現來看 , 都與腎精虧密切相
關[ 1 ]
。紫河車屬於血肉有情之品 , 擅長**填精 , 筆
者擬從動物實驗著後來驗證其防治 AD的效果及其機
製。β澱粉樣蛋白 (β2 Amyl oid, Aβ) 異常沉積是 AD
患者腦組織內老年斑形成的主要原因; 近年來研究表
明β澱粉樣前體蛋白 (βAPP) 基因突變是造成 Aβ
異常沉積的關鍵因素[ ]
。本文研究紫河車乾預 Aβ和
βAPPmRNA的表達 , 現報告如下。
1 材料與方法
1·1 動物與分組、分點 選取健康 SD 66隻 , 3～4
月齡 , 體重 180～250 g, 清潔級 , 雌雄各半 , 隨機分
為模型組、**組、預防組、假手術組、空白組 , 每
組分 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d 5個觀察點 , 每個觀
察點 3隻實驗大鼠。
1·2 AD大鼠模型的建立 在腦立體定位儀上 , 用
微量注射器將 OA 1μl (相當於 100 ng) 注入大鼠杏
仁核 (前囟後 2112 mm、矢狀縫旁 4 mm, 深 8 mm) ,
10 min左右注射完, 留針 5 min。其中假手術組緩注
射等量的生理鹽水。
1·3 實驗大鼠的給藥 以紫河車生藥計 2 g·kg
- 1
·d
- 1
給藥。將紫河車加工成極細粉末 , 以 100 ml
水: 25 g紫河車粉末的比例配製成液體 , 給實驗大鼠
中給藥者灌胃給藥。預防組給藥: 在造模前 7 d開始給藥 , 連續 7 d, 造模後不給藥。其他給藥組給藥:
即**組和假手術組在造模後即開始給藥 , 直到其被
取腦製標本。
1·4 行為學觀察 按觀察目的設定實驗大鼠的行為
學觀察的時間點。用避暗箱進行被動回避反應測試 ,
分彆進行保留試驗、獲得試驗 , 記錄測試數據[ 2 ]
。用
穿梭箱進行主動回避反應測試 , 分彆進行保留試驗、
獲得試驗 , 記錄測試數據[ 3 ]
。
1·5 腦組織的切片製備 各組常規灌注固定 30 min
後行石蠟切片 , 隨機選取海馬相鄰切片分彆作**化
實驗和原位雜交實驗。
1·6 Aβ的**組化測試 主要步驟: 石蠟切片常
規脫蠟至水 -水浴修複抗原 - PBS洗 -滴加抗原修複
液 - PBS洗 -滴加正常羊血清封閉液 -滴加 -抗 (兔
抗鼠 IgG) 37℃, 30 min至 2 h或者 20℃ 60～120
min, 也可以 4℃ 過夜 (先 37℃, 60 min至 2 h孵育 ,
再 4℃過夜 ) - PBS洗 -滴加生物素化山羊抗兔 IgG
(即二抗 ) , 孵育 20 min - PBS洗 -滴加 S ABC -即三
述兩者之間。⑵ 造模後對各組被動逃避反應 “保留 ”
的影響: 模型組對已經獲得的對電擊的記憶遭到破
壞 , 而假手術組則保留較好 , **組在**一段時間
後 , 對電擊記憶恢複比模型組好 , 預防組對電擊記憶
在術後短期內比模型組好。
2·2 各組大鼠主動逃避反應行為的測試結果 ⑴造
模後對各組大鼠主動回避反應 “獲得 ”的影響: 測
試結果表明模型組的正確回避率*低 , 且在隨後的繼
續訓練中回避反應的正確率增長*慢; 假手術組的正
確回避率高 , 在隨後的繼續訓練中回避反應的正確率
增長快; **組與預防組介於兩者之間。⑵造模損傷
後各組大鼠主動逃避反應 “保留 ”的改變: 結果表
明模型組大鼠的主動逃避反應行為的 “保留 ”有嚴
重損害 , 而假手術組這種表現*輕 , **組在**一
段時間後對主動回避反應的記憶恢複得比模型組好 ,
預防組對主動回避反應的記憶在短期內比模型組好。
2·3 Aβ**組化測試結果 觀察經 Aβ**組化
測試後各切片 , 陽性表達細胞的胞漿呈淺棕黃色 , 陽抗 - PBS洗 -滴加 DAB, 室溫下 , 背光 (暗室 ) 顯
色 5～30 min, 鏡下控製反應時間 , 有表達後蒸餾水
洗 5 min /次 × 3以中止反應 -封片 -在顯微鏡下觀察
計數。
1·7 β2 APPmRNA的原位雜交測試 主要步驟 ⑴石
蠟切片經常規脫蠟至水。30% H2O2 1份 +蒸餾水 10
份混合滅活內源性酶 , 胃蛋白酶暴露 mRNA核酸片
段 , 0104%多聚甲醛 /011MPBS (pH 712～716) 後固
定; ⑵ 預雜交: 乾雜交盒底部加 20%甘油 20 ml以保
持濕度 , 每張切片加預雜交液 20μl。恒溫箱 38～
42℃ 2～4 h。吸取多餘液體 , 不洗; ⑶ 雜交: 按每張
切片 20μl雜交液 (β2 APPmRNA探針雜交液 ) 加在
切片上。恒溫箱 38～42℃雜交過夜; ⑷雜交後洗滌:
滴加封閉液 37℃ 30 min, 甩去多餘液體 , 不洗; ⑸
滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃ 60 min或室溫 120
min, 用 PBS洗 5 min × 4。勿用其它緩衝液和蒸餾水
洗滌; ⑹ 染色、封片步驟同**組化。
1·8 統計學處理 使用 SPSS 1110統計軟件 , 所有
結果用 x ±s表示 , 各組間比較用方差分析 , 組間兩
性細胞出現在皮質區、海馬區等區域 , 細胞種類有神
經元、大小膠質細胞。各時間點**組化陽性細胞數
見表 1。資料顯示**組與模型組比較 , 在 12 h、1
d、3 d這三個時間點上 , 陽性細胞數目多少兩者差異
無統計學意義 ( P > 0105) , 而在 7 d、14 d點 , 陽
性細胞數前者少於後者 ( t = 4133, P < 0105) ; 預防
組與模型組比較, 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點
上 , 陽性細胞數前者少於後者 ( t = 14113, P <
0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上 , 陽性細胞數
兩者相比差異無統計學意義 ( P > 0105)。
2·4 β2 APPmRNA的原位雜交測試結果 觀察 β2
APPmRNA的原位雜交測試後的切片 , 陽性表達細胞
的細胞漿呈深棕黃色 , 細胞種類有神經元、大小膠質
細胞 , 陽性細胞出現在皮質區、海馬區等區域 , 各組
各時間點陽性細胞數目如表 1。**組與模型組比
較 , 在 12h、1 d、3 d這三個時間點上 , 陽性細胞數
目兩者差異無統計學意義 ( P > 0105 ) , 而在 7 d、
14 d點 , **組的陽性表達數目明顯少於模型組的陽
性表達數目 ( t = 4127, P < 0105) ; 預防組與模型組兩比較用 q檢驗。
2 結果
2·1 各組大鼠被動回避反應行為測試結果 ⑴造模
後各組實驗大鼠被動回避反應 “ 獲得 ”能力的改變:
模型組不能學會被動逃避反應 , 而假手術組大鼠則能
學會被動逃避反應 , **與預防組的學習能力介於上
比較 , 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點上 , 預防組的
陽性表達點明顯少於模型組的陽性表達點 ( t
12138, P < 0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上
兩者陽性表達點數目差異無統計學意義 ( P
0105)。表 1 Aβ**組化、 β2 APPmRNA的原位雜交測試結果 ( x ±s , n = 3)
組彆 Aβ
12h 1d 3d 7d 14d
β2 APPmRNA
12h 1d 3d 7d 14d
A模型組 46 . 3 ±
6 . 1101
63 . 0 ±
6 . 2451
51 . 0 ±
4 . 5826
29 . 7 ±
2 . 5166
22 . 3 ±
3 . 5118
123 . 0 ±
6 . 5574
100 . 7 ±
7 . 6376
79 . 3 ±
9 . 0737
43 . 0 ±
6 . 5574
27 . 7 ±
2 . 5166
B**組 43 . 7 ±
4 . 7258
57 . 3 ±
5 . 7573
47 . 7 ±
2 . 5166
22 . 0 ±
3 . 60553
10 . 7 ±
1 . 52753
117 . 0 ±
2 . 0000
91 . 3 ±
4 . 5092
71 . 7 ±
6 . 1101
29 . 3 ±
6 . 02273
10 . 7 ±
5 . 03323
C預防組 31 . 7 ±
4 . 16333
45 . 0 ±
5 . 56783
33 . 3 ±
3 . 05513
27 . 0 ±
3 . 0000
20 . 3 ±
2 . 5166
86 . 3 ±
10 . 11623
54 . 7 ±
12 . 66283
43 . 7 ±
10 . 50393
35 . 7 ±
3 . 5512
24 . 7 ±
6 . 0277
D假手術組 2 . 0 ±
3 . 46433 3
3 . 3 ±
3 . 05503 3
1 . 7 ±
1 . 52753 3
0 ±
03 3
0 ±
03 3
23 . 0 ±
13 . 45363 3
22 . 3 ±
6 . 11013 3
13 . 0 ±
3 . 60553 3
10 . 0 ±
2 . 64573 3
8 . 3 ±
1 . 52753 3
空白組 0 ±
03 3
0 ±
03 3
7 . 3 ±
± 3 . 05513 3
6 . 7 ±
2 . 47213 3
注:與同時間點模型組相比, t≥2158,
3
P < 0105, t≥4146,
3 3
P < 0101
3 討論
阿爾茨海默病是一種原發變性型老年癡呆 ,其特
征特病理改變有:腦組織內出現大量老年斑 ( SP)、 神經
纖維纏結 (NFTS)、 神經元數量減少和顆粒空泡變性。
AD的發病機理十分複雜 ,可能是多因素相互作用的結
果 ,其中 Aβ異常表達是形成老年斑的關鍵因素 , tau蛋
白異常表達是形成 NFTS的關鍵因素。
異常 Aβ在持續性的大腦細胞損害中扮演了重要
AD中病理改變的影響。AR I等[ 9 ]
發現雌**無論在
Aβ作用之前、 還是作用之後 ,或同時給予 ,均可阻斷
Aβ的神毒性作用。本實驗研究結果表明紫河車對 AD
模型大鼠的乾預對 AD模型大鼠腦組織中 Aβ增多與
沉積有減少作用 ,與預期相一致。紫河車乾預後減少
AD模型動物腦組織內部 Aβ的沉積增多。Aβ的沉積
的主要原因之一是 APP 的增多 , 所以一般認為角色 ,其神經毒性與 AD關係主要表現在以下幾方麵:
打破鈣平衡和產生氧自由由 ,能夠增強穀氨酸毒性 ,誘
導一氧化氮的產生 ,導致大腦血管機能障礙 ,誘導神經
元凋亡 ,**神經係統的炎性反應。因此 Aβ在研究
AD的實驗中常用作評價實驗效果的重要指標之一[ 4 ]
。
He等[ 5 ]
用 OA注入大鼠的海馬區 ,結果表明實驗
大鼠出現行為學異常 ,其腦組織 NFTS形成、 老年斑出
現、 Aβ表達增加等合乎 AD的病理改變。用 OA注於
實驗大鼠的杏仁核中 ,其設想是杏仁核屬邊緣係統部
分 ,而邊緣係統與記憶和情緒都有極密切關係[ 6 ]
。本
實驗結果顯示 ,造模後實驗大鼠行為學出現異常 ,如記
憶力衰退 ,認知能力減弱 ,靜默少動等;化學檢測其腦
組織顯示有 Aβ及βAPPmRNA表達異常地增多;陽性
細胞在新皮層 ,海馬區等等都有出現 ,並以神經元和膠
質細胞受損為主。
**方藥對 AD模型動物腦內的 Aβ含量的影響
的研究是近幾年來開展的 ,研究結果表明**方藥確
有降低 AD模型動物腦內的 Aβ含量作用。趙長安
等[ 7 ]
研究表明:**填精方能抑製 AlCl 3 引起的血清
Aβ的升高 ,糾正逃避行為方式異常 ,提高大鼠的逃避
正確率 ,縮短逃避潛伏期 ,改善學習記憶能力。陳雲波
察βAPPmRNA的變化可以與 Aβ的變化相互印證 ,免
疫組化也可以與原位雜交相互印證。本實驗研究表
明 ,紫河車乾預 AD模型大鼠後 ,β2 APPmRNA的過度
表達受到抑製 ,這表明了紫河車抑製 β2 APPmRNA表
達可能是其改善 AD病理改變的機製之一。
AD的臨床表現為記憶力減退和認知功能減退 ,獨
立生活能力降低等。中醫認為 , AD一病 ,其病位在腦
與腎密切相關 ,腦為元神之府 ,主記憶、 智慧;中醫理論
認為,腎是先天之本 ,精神之舍 ,主水濟心 ,安誌養神 ,
主骨生髓 ,充腦益智 ,腎病則髓空善忘 ,神亂意失。因
而腎精不足是 AD發病的主要病機。 《本草綱目 》 亦
雲:“ 精與誌皆腎經之所藏也 ,腎精不足,則誌氣衰 ,不
能上通於心 ,故迷惑善忘 ” 。楊柏燦等[ 10 ]
據臟腑及氣
血陰陽定性把 139例 Alzhei mer型癡呆分為 6個證型 ,
涉及腎虛的比較達 91137%。說明從腎論治是** AD
的主要治法之一。林長興等[ 11 ]
以調心方和**方治
療 AD進行對照 ,發現調心方**有效率為 71111% ,
而**方則為 77114%。這充分說明中醫藥乾預對 AD
模型動物的行為學改變的影響確有改善的作用。
本實驗中用於乾預 AD模型大鼠的紫可車是一味
**填精名藥 ,有助陽補精 ,益血**功效 ,臨床上用
βAPPmRNA的異常與 AD的形成也有密切的關係。觀等[ 8 ]
研究表明**益智方對被 Aβ 25～35損傷的 NG
108～15細胞有保護作用。本實驗用於乾預 AD模型
大鼠的紫河車為**填精名藥 ,從臨床實踐看 ,能減輕
AD病的症狀。紫河車中某些成分如雌**等可能對
於腎氣不足 ,精血衰少所致諸證。如《日用本草 》 說紫
河車“ 主虛損勞極 ,癲癇 ,失誌恍惚 ,安心養血、 **補
腎 ” 。章生銀[ 12 ]
用小鼠跳台法觀察紫河車水煎液對由
東莨菪堿及亞硝酸鈉所致的小鼠記憶損傷過程的影響,
核糖核酸 (βAPPmRNA)表達改變 ,探討紫河車改善阿爾茨海默病模型大鼠症狀的部分機製。方法 用 Okadaic acid (OA)注於實驗
大鼠腦內杏仁核建立 AD動物模型 ,用避暗法和穿梭箱法測試實驗大鼠的學習記憶能力 ,用**組織化學方法顯示實驗大鼠腦組織
內 Aβ表達的變化 ,用原位雜交方法顯示實驗大鼠腦組織內βAPPmRNA表達的變化。結果 用紫河車**和預防一段時間後的
AD模型大鼠 ,其學習記憶能力的測試成績明顯優於同時間點模型組大鼠的成績 ( P < 0105) ,其腦組織內 Aβ、 βAPPmRNA表達數
量也明顯少於同時間點模型組大鼠腦組織內的 Aβ、 βAPPmRNA表達數量 ( P < 0105)。結論 經紫河車乾預後 ,AD模型大鼠的行
為異常得到改善 ,同時其腦組織內 Aβ、 βAPPmRNA表達也受到抑製。
[關鍵詞 ] 阿爾茨海默病;紫河車;澱粉樣β蛋白;澱粉樣β蛋白前體
Effect of Ziheche onβ2 amylo id,β2 amylo id precursor prote i n mRNA i n bra i n tissue of ra tmodel of Alzhe i mer’ s d isea se
YUAN M eng2 sh i , CHEN X iang2liang, ZHOU De2 sheng, YANG Q i2 dong . First Affiliated Hos p ital of Hunan University of TCM, Changsha
410007, China
【Abstract】 Objecti ve To observe the changes ofβ2 Amyl oid,β2 Amyl oid p recurs or p r otein mRNA in brain tissue of rat model of
Alzhei mer’ sDisease (AD) after interventi on with Ziheche and investigate the mechanis ms of enhancing learning and memory in ratmodel of
Alzhei mer’ sDisease by Ziheche . Methods The rat model of Alzhei mer’ s diseases was established by stereotaxic injecti on of okadaic acid
(OA) t o one of amygdala comp lexes . The learning and memory ability of the rats was evaluated . The i mmunohist ochemistry was used t o i2
dentify the alterati ons ofβAmyl oid in brain tissue, and the in situs hybridizati on was used t o identify the alterati ons ofβAPP mRNA in brain
tissue . Results After the ratmodel of Alzhei mer disease were treated and p revented with Ziheche, their learning and memory ability was
better than those in ratmodel ofAD without treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) , the exp ressi on ofβAmyl oid, βAPP mRNA in
brain tissue was less than that not treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) . Conclusi on After treated and p revented with Ziheche,
the learning and memory ability of the ratmodel ofAD was enhanced, and the exp ressi on of theβAmyl oid,βAPP mRNA in brain tissue of
the ratmodel ofAD decreased .
【Key words】 Alzhei mer disease; Placenta hominis ;Amyl oid beta2 p r otein;Amyl oid beta2 p r otein p recurs or
從臨床實踐中表明阿爾茨海默病 (AD) 無論從
發病機製還是臨床表現來看 , 都與腎精虧密切相
關[ 1 ]
。紫河車屬於血肉有情之品 , 擅長**填精 , 筆
者擬從動物實驗著後來驗證其防治 AD的效果及其機
製。β澱粉樣蛋白 (β2 Amyl oid, Aβ) 異常沉積是 AD
患者腦組織內老年斑形成的主要原因; 近年來研究表
明β澱粉樣前體蛋白 (βAPP) 基因突變是造成 Aβ
異常沉積的關鍵因素[ ]
。本文研究紫河車乾預 Aβ和
βAPPmRNA的表達 , 現報告如下。
1 材料與方法
1·1 動物與分組、分點 選取健康 SD 66隻 , 3～4
月齡 , 體重 180～250 g, 清潔級 , 雌雄各半 , 隨機分
為模型組、**組、預防組、假手術組、空白組 , 每
組分 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d 5個觀察點 , 每個觀
察點 3隻實驗大鼠。
1·2 AD大鼠模型的建立 在腦立體定位儀上 , 用
微量注射器將 OA 1μl (相當於 100 ng) 注入大鼠杏
仁核 (前囟後 2112 mm、矢狀縫旁 4 mm, 深 8 mm) ,
10 min左右注射完, 留針 5 min。其中假手術組緩注
射等量的生理鹽水。
1·3 實驗大鼠的給藥 以紫河車生藥計 2 g·kg
- 1
·d
- 1
給藥。將紫河車加工成極細粉末 , 以 100 ml
水: 25 g紫河車粉末的比例配製成液體 , 給實驗大鼠
中給藥者灌胃給藥。預防組給藥: 在造模前 7 d開始給藥 , 連續 7 d, 造模後不給藥。其他給藥組給藥:
即**組和假手術組在造模後即開始給藥 , 直到其被
取腦製標本。
1·4 行為學觀察 按觀察目的設定實驗大鼠的行為
學觀察的時間點。用避暗箱進行被動回避反應測試 ,
分彆進行保留試驗、獲得試驗 , 記錄測試數據[ 2 ]
。用
穿梭箱進行主動回避反應測試 , 分彆進行保留試驗、
獲得試驗 , 記錄測試數據[ 3 ]
。
1·5 腦組織的切片製備 各組常規灌注固定 30 min
後行石蠟切片 , 隨機選取海馬相鄰切片分彆作**化
實驗和原位雜交實驗。
1·6 Aβ的**組化測試 主要步驟: 石蠟切片常
規脫蠟至水 -水浴修複抗原 - PBS洗 -滴加抗原修複
液 - PBS洗 -滴加正常羊血清封閉液 -滴加 -抗 (兔
抗鼠 IgG) 37℃, 30 min至 2 h或者 20℃ 60～120
min, 也可以 4℃ 過夜 (先 37℃, 60 min至 2 h孵育 ,
再 4℃過夜 ) - PBS洗 -滴加生物素化山羊抗兔 IgG
(即二抗 ) , 孵育 20 min - PBS洗 -滴加 S ABC -即三
述兩者之間。⑵ 造模後對各組被動逃避反應 “保留 ”
的影響: 模型組對已經獲得的對電擊的記憶遭到破
壞 , 而假手術組則保留較好 , **組在**一段時間
後 , 對電擊記憶恢複比模型組好 , 預防組對電擊記憶
在術後短期內比模型組好。
2·2 各組大鼠主動逃避反應行為的測試結果 ⑴造
模後對各組大鼠主動回避反應 “獲得 ”的影響: 測
試結果表明模型組的正確回避率*低 , 且在隨後的繼
續訓練中回避反應的正確率增長*慢; 假手術組的正
確回避率高 , 在隨後的繼續訓練中回避反應的正確率
增長快; **組與預防組介於兩者之間。⑵造模損傷
後各組大鼠主動逃避反應 “保留 ”的改變: 結果表
明模型組大鼠的主動逃避反應行為的 “保留 ”有嚴
重損害 , 而假手術組這種表現*輕 , **組在**一
段時間後對主動回避反應的記憶恢複得比模型組好 ,
預防組對主動回避反應的記憶在短期內比模型組好。
2·3 Aβ**組化測試結果 觀察經 Aβ**組化
測試後各切片 , 陽性表達細胞的胞漿呈淺棕黃色 , 陽抗 - PBS洗 -滴加 DAB, 室溫下 , 背光 (暗室 ) 顯
色 5～30 min, 鏡下控製反應時間 , 有表達後蒸餾水
洗 5 min /次 × 3以中止反應 -封片 -在顯微鏡下觀察
計數。
1·7 β2 APPmRNA的原位雜交測試 主要步驟 ⑴石
蠟切片經常規脫蠟至水。30% H2O2 1份 +蒸餾水 10
份混合滅活內源性酶 , 胃蛋白酶暴露 mRNA核酸片
段 , 0104%多聚甲醛 /011MPBS (pH 712～716) 後固
定; ⑵ 預雜交: 乾雜交盒底部加 20%甘油 20 ml以保
持濕度 , 每張切片加預雜交液 20μl。恒溫箱 38～
42℃ 2～4 h。吸取多餘液體 , 不洗; ⑶ 雜交: 按每張
切片 20μl雜交液 (β2 APPmRNA探針雜交液 ) 加在
切片上。恒溫箱 38～42℃雜交過夜; ⑷雜交後洗滌:
滴加封閉液 37℃ 30 min, 甩去多餘液體 , 不洗; ⑸
滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃ 60 min或室溫 120
min, 用 PBS洗 5 min × 4。勿用其它緩衝液和蒸餾水
洗滌; ⑹ 染色、封片步驟同**組化。
1·8 統計學處理 使用 SPSS 1110統計軟件 , 所有
結果用 x ±s表示 , 各組間比較用方差分析 , 組間兩
性細胞出現在皮質區、海馬區等區域 , 細胞種類有神
經元、大小膠質細胞。各時間點**組化陽性細胞數
見表 1。資料顯示**組與模型組比較 , 在 12 h、1
d、3 d這三個時間點上 , 陽性細胞數目多少兩者差異
無統計學意義 ( P > 0105) , 而在 7 d、14 d點 , 陽
性細胞數前者少於後者 ( t = 4133, P < 0105) ; 預防
組與模型組比較, 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點
上 , 陽性細胞數前者少於後者 ( t = 14113, P <
0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上 , 陽性細胞數
兩者相比差異無統計學意義 ( P > 0105)。
2·4 β2 APPmRNA的原位雜交測試結果 觀察 β2
APPmRNA的原位雜交測試後的切片 , 陽性表達細胞
的細胞漿呈深棕黃色 , 細胞種類有神經元、大小膠質
細胞 , 陽性細胞出現在皮質區、海馬區等區域 , 各組
各時間點陽性細胞數目如表 1。**組與模型組比
較 , 在 12h、1 d、3 d這三個時間點上 , 陽性細胞數
目兩者差異無統計學意義 ( P > 0105 ) , 而在 7 d、
14 d點 , **組的陽性表達數目明顯少於模型組的陽
性表達數目 ( t = 4127, P < 0105) ; 預防組與模型組兩比較用 q檢驗。
2 結果
2·1 各組大鼠被動回避反應行為測試結果 ⑴造模
後各組實驗大鼠被動回避反應 “ 獲得 ”能力的改變:
模型組不能學會被動逃避反應 , 而假手術組大鼠則能
學會被動逃避反應 , **與預防組的學習能力介於上
比較 , 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點上 , 預防組的
陽性表達點明顯少於模型組的陽性表達點 ( t
12138, P < 0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上
兩者陽性表達點數目差異無統計學意義 ( P
0105)。表 1 Aβ**組化、 β2 APPmRNA的原位雜交測試結果 ( x ±s , n = 3)
組彆 Aβ
12h 1d 3d 7d 14d
β2 APPmRNA
12h 1d 3d 7d 14d
A模型組 46 . 3 ±
6 . 1101
63 . 0 ±
6 . 2451
51 . 0 ±
4 . 5826
29 . 7 ±
2 . 5166
22 . 3 ±
3 . 5118
123 . 0 ±
6 . 5574
100 . 7 ±
7 . 6376
79 . 3 ±
9 . 0737
43 . 0 ±
6 . 5574
27 . 7 ±
2 . 5166
B**組 43 . 7 ±
4 . 7258
57 . 3 ±
5 . 7573
47 . 7 ±
2 . 5166
22 . 0 ±
3 . 60553
10 . 7 ±
1 . 52753
117 . 0 ±
2 . 0000
91 . 3 ±
4 . 5092
71 . 7 ±
6 . 1101
29 . 3 ±
6 . 02273
10 . 7 ±
5 . 03323
C預防組 31 . 7 ±
4 . 16333
45 . 0 ±
5 . 56783
33 . 3 ±
3 . 05513
27 . 0 ±
3 . 0000
20 . 3 ±
2 . 5166
86 . 3 ±
10 . 11623
54 . 7 ±
12 . 66283
43 . 7 ±
10 . 50393
35 . 7 ±
3 . 5512
24 . 7 ±
6 . 0277
D假手術組 2 . 0 ±
3 . 46433 3
3 . 3 ±
3 . 05503 3
1 . 7 ±
1 . 52753 3
0 ±
03 3
0 ±
03 3
23 . 0 ±
13 . 45363 3
22 . 3 ±
6 . 11013 3
13 . 0 ±
3 . 60553 3
10 . 0 ±
2 . 64573 3
8 . 3 ±
1 . 52753 3
空白組 0 ±
03 3
0 ±
03 3
7 . 3 ±
± 3 . 05513 3
6 . 7 ±
2 . 47213 3
注:與同時間點模型組相比, t≥2158,
3
P < 0105, t≥4146,
3 3
P < 0101
3 討論
阿爾茨海默病是一種原發變性型老年癡呆 ,其特
征特病理改變有:腦組織內出現大量老年斑 ( SP)、 神經
纖維纏結 (NFTS)、 神經元數量減少和顆粒空泡變性。
AD的發病機理十分複雜 ,可能是多因素相互作用的結
果 ,其中 Aβ異常表達是形成老年斑的關鍵因素 , tau蛋
白異常表達是形成 NFTS的關鍵因素。
異常 Aβ在持續性的大腦細胞損害中扮演了重要
AD中病理改變的影響。AR I等[ 9 ]
發現雌**無論在
Aβ作用之前、 還是作用之後 ,或同時給予 ,均可阻斷
Aβ的神毒性作用。本實驗研究結果表明紫河車對 AD
模型大鼠的乾預對 AD模型大鼠腦組織中 Aβ增多與
沉積有減少作用 ,與預期相一致。紫河車乾預後減少
AD模型動物腦組織內部 Aβ的沉積增多。Aβ的沉積
的主要原因之一是 APP 的增多 , 所以一般認為角色 ,其神經毒性與 AD關係主要表現在以下幾方麵:
打破鈣平衡和產生氧自由由 ,能夠增強穀氨酸毒性 ,誘
導一氧化氮的產生 ,導致大腦血管機能障礙 ,誘導神經
元凋亡 ,**神經係統的炎性反應。因此 Aβ在研究
AD的實驗中常用作評價實驗效果的重要指標之一[ 4 ]
。
He等[ 5 ]
用 OA注入大鼠的海馬區 ,結果表明實驗
大鼠出現行為學異常 ,其腦組織 NFTS形成、 老年斑出
現、 Aβ表達增加等合乎 AD的病理改變。用 OA注於
實驗大鼠的杏仁核中 ,其設想是杏仁核屬邊緣係統部
分 ,而邊緣係統與記憶和情緒都有極密切關係[ 6 ]
。本
實驗結果顯示 ,造模後實驗大鼠行為學出現異常 ,如記
憶力衰退 ,認知能力減弱 ,靜默少動等;化學檢測其腦
組織顯示有 Aβ及βAPPmRNA表達異常地增多;陽性
細胞在新皮層 ,海馬區等等都有出現 ,並以神經元和膠
質細胞受損為主。
**方藥對 AD模型動物腦內的 Aβ含量的影響
的研究是近幾年來開展的 ,研究結果表明**方藥確
有降低 AD模型動物腦內的 Aβ含量作用。趙長安
等[ 7 ]
研究表明:**填精方能抑製 AlCl 3 引起的血清
Aβ的升高 ,糾正逃避行為方式異常 ,提高大鼠的逃避
正確率 ,縮短逃避潛伏期 ,改善學習記憶能力。陳雲波
察βAPPmRNA的變化可以與 Aβ的變化相互印證 ,免
疫組化也可以與原位雜交相互印證。本實驗研究表
明 ,紫河車乾預 AD模型大鼠後 ,β2 APPmRNA的過度
表達受到抑製 ,這表明了紫河車抑製 β2 APPmRNA表
達可能是其改善 AD病理改變的機製之一。
AD的臨床表現為記憶力減退和認知功能減退 ,獨
立生活能力降低等。中醫認為 , AD一病 ,其病位在腦
與腎密切相關 ,腦為元神之府 ,主記憶、 智慧;中醫理論
認為,腎是先天之本 ,精神之舍 ,主水濟心 ,安誌養神 ,
主骨生髓 ,充腦益智 ,腎病則髓空善忘 ,神亂意失。因
而腎精不足是 AD發病的主要病機。 《本草綱目 》 亦
雲:“ 精與誌皆腎經之所藏也 ,腎精不足,則誌氣衰 ,不
能上通於心 ,故迷惑善忘 ” 。楊柏燦等[ 10 ]
據臟腑及氣
血陰陽定性把 139例 Alzhei mer型癡呆分為 6個證型 ,
涉及腎虛的比較達 91137%。說明從腎論治是** AD
的主要治法之一。林長興等[ 11 ]
以調心方和**方治
療 AD進行對照 ,發現調心方**有效率為 71111% ,
而**方則為 77114%。這充分說明中醫藥乾預對 AD
模型動物的行為學改變的影響確有改善的作用。
本實驗中用於乾預 AD模型大鼠的紫可車是一味
**填精名藥 ,有助陽補精 ,益血**功效 ,臨床上用
βAPPmRNA的異常與 AD的形成也有密切的關係。觀等[ 8 ]
研究表明**益智方對被 Aβ 25～35損傷的 NG
108～15細胞有保護作用。本實驗用於乾預 AD模型
大鼠的紫河車為**填精名藥 ,從臨床實踐看 ,能減輕
AD病的症狀。紫河車中某些成分如雌**等可能對
於腎氣不足 ,精血衰少所致諸證。如《日用本草 》 說紫
河車“ 主虛損勞極 ,癲癇 ,失誌恍惚 ,安心養血、 **補
腎 ” 。章生銀[ 12 ]
用小鼠跳台法觀察紫河車水煎液對由
東莨菪堿及亞硝酸鈉所致的小鼠記憶損傷過程的影響,
