地黃益知浸膏對老年性癡呆大鼠海馬磷酸化creb、gsk-3β表達的影響

地黃益知浸膏對老年性癡呆大鼠海馬磷酸化creb、gsk-3β表達的影響穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttlebox、主動回避實驗、active avoidancesystem

穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttlebox、主動回避實驗、active avoidancesystem

【摘要】 目的 觀察地黃益知浸膏（dihuang yizhi jingao,dhyzjg）對老年性癡呆（ad）大鼠學習記憶能力及海馬組織環磷酸腺苷反應單元結合蛋白(cyclicamp response element-binding protein，creb)、pcrebser133、糖原合成酶激酶 (glycogen synthase kinase，gsk)-3β、pgsk-3βser9表達的影響，探索其防治ad的可能機製。方法 采用右側海馬注射β澱粉樣肽（aβ）25～35製備ad大鼠模型，用穿梭箱及水迷宮檢測其學習記憶能力；應用**印跡法測定其creb、gsk-3β的磷酸化水平。結果 dhyzjg可劑量依賴性地改善ad大鼠的學習、記憶能力;與ad組相比,dhyzjg高劑量組海馬pcrebser133水平顯著增高 (p＜0.01),pgsk-3βser9水平明顯增高(p＜0.05)。結論 dhyzjg可明顯改善ad大鼠認知功能障礙,其機製可能與其上調海馬creb、gsk-3β蛋白的磷酸化水平有關。穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

【關鍵詞】 地黃益知浸膏；老年性癡呆；環磷酸腺苷反應單元結合蛋白(creb)；糖原合成酶激酶(gsk)-3β

穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

　　老年性癡呆(ad) 屬於一種起病隱匿的進行性發展的癡呆，是癡呆中*常見的一種進展性腦變性**。澱粉樣蛋白沉積、神經纖維纏結、神經元丟失是ad的主要病理改變。近年來發現，環磷酸腺苷反應單元結合蛋白(cyclicamp response element-binding protein,creb) 是細胞內多種信號通路的一種關鍵成分，其蛋白磷酸化水平的變化可影響神經元突觸可塑性和神經網絡的形成〔1，2〕。糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，gsk)-3β是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,其廣泛存在於各種細胞中,參與多種信號轉導通路調節,在tau蛋白磷酸化調節中起非常重要的作用 〔3〕。體外研究表明aβ可明顯抑製培養的海馬神經元中的長時程增強電位及pka/creb介導的信號轉導途徑，激活gsk-3β並以gsk-3β依賴的方式引起神經元丟失〔4，5〕。地黃益知浸膏（dihuang yizhi jingao，dhyzjg）是采用重慶名中醫王輝武教授提供的驗方所製,在臨床**中具有改善和延緩ad認知衰退的作用。目前,dhyzjg對ad尤其是其信號轉導通路的作用機製尚不清楚。本研究旨在以澱粉樣蛋白級聯假說為切入點,觀察dhyzjg是否能調節ad大鼠行為學及海馬creb、gsk-3β蛋白的磷酸化水平，探討dhyzjg是否通過改善腦組織神經元存活信號途徑的功能以及蛋白激酶／蛋白磷酸酯酶磷酸化係統失衡而發揮**ad的作用。穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

　　1 材料與方法穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

　　1.1 實驗動物分組 wistar大鼠，雄性96隻,體重(250±20)g,第三軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心提供，清潔級。經穿梭箱訓練粗篩後,淘汰6隻，隨機均分為假手術組、模型組、dhyzjg低、中、高劑量組、多奈呱齊（donepezil）組,每組15隻。dhyzjg由熟地黃、山茱萸、石菖蒲、遠誌、巴戟天等8味中藥（重慶漢邦天然藥業有限公司）組成,重慶中藥研究所鑒定為純正中藥材,並由該研究所經水煮醇提法,製成中藥流浸膏（1 g流浸膏相當於2g生藥含量）。置0～4℃ 冰箱保存。在實驗前對dhyzjg流浸膏進行毒理實驗,ld50＞50g（生藥）/kg。穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

　　1.2 方法穿梭、穿梭實驗、穿梭箱、shuttle box、主動回避實驗、active avoidance system

　　1.2.1  主要試劑與儀器  多奈呱齊由衛材(中國)藥業有限公司提供;creb 抗體，pcrebser133抗體、pgsk-3βser9抗體均為cellsignaling公司產品；gsk-3β抗體購自北京博奧森試劑公司;aβ25～35為首都醫科大學宣武醫院多肽室提供；β-actin抗體均為santacruz公司產品；凝膠掃描成像係統(bio-rad公司，美國);電腦控製的穿梭箱係統（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所）、大鼠腦立體定位儀%