恐懼實驗方法

恐懼實驗方法

   暗示與關聯條件恐懼（cued and contextual fearconditioning）也加場景恐懼實驗，是基於巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學習、記憶不悅經曆（aversiveexperience）和環境暗示之間關聯的能力。常用聲音或光暗示作為條件刺激（conditioningstimulus，CS），以厭惡性刺激（如足電擊）作為非條件刺激（unconditionedstimulus，US），二者配對出現。經過這種CS-US訓練，動物不僅學會聲音和電擊之間存在聯係，而且知道電擊和周圍環境之間也存在某種聯係（context）。前者為聽覺暗示條件恐懼（auditorycue fear conditioning）或暗示條件恐懼（cued fearconditioning），後者為關聯條件恐懼（contextual fearconditioning）。恐懼是非靈長類動物少有的幾種情感反應之一。動物經曆條件恐懼後，當再次接觸條件刺激時，會產生一係列的生理反應，包括自主神經緊張、應激**分泌增加以及防禦行為增多，等等。凝滯（freezing）即是動物防禦行為的一種，是指動物除呼吸之外冇有任何其他活動，猶如在黑夜處於迎麵而來的汽車強燈照射之下的驚鹿，一動不動。它被認為是評價齧齒類動物恐懼的可靠指標。
 
  參與條件關聯學習過程的腦部結構主要為杏仁核和海馬。前者調節恐懼，後者調節與恐懼性事物相關聯的學習認知。所以，這一模型主要用於杏仁核和海馬依賴的記憶。動物不需要禁水或禁食，且實驗設備較為簡單，訓練時間相對較短。因此，該模型廣泛用於轉基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。

 一、實驗設備
 
包括條件恐懼箱、隔音箱和關聯條件箱，由上海軟隆科技發展有限公司研
發。條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯的電擊發生器（可產生0.1~1.0mA的各種強度的電擊）、聲音發生器（可產生寬頻的卡嗒聲或低頻音），並與計算機相聯。隔音箱裝有一燈、一小風扇（用於通風和產生背景音）以及一個與聲音發生器相聯的擴音器。隔音箱門上有一貓眼，用於觀察操作箱內的動物。一個隔音箱內可放置兩個操作箱，這樣可同時觀測兩隻動物，但兩動物彼此不能互相看見。關聯箱由透明有機玻璃製成，有可移動的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動物滑至格柵下麵，格柵條之間距離應足夠短。對小鼠和年幼大鼠，關聯條件箱通常為26cm*21cm*10cm；格柵地板由不鏽鋼條（直徑1.5mm，中央間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm）組成。對成年大鼠，關聯箱通常為29cm*23.5cm*19.5cm，格柵地板包括16根不鏽鋼條（直徑2.5cm、中央間距為1.25cm）。此外，還有電壓計和聲強計，用來檢測刺激強度。
 
一、實驗方法
分為訓練和測試兩階段
（一）訓練階段（**天）
1．調試儀器，以確保格柵地板有電流刺激，擴音器有聲音刺激，並分彆記錄電流強度和聲音強度（分貝）。
2．將大鼠放入條件恐懼箱2min（A相），記錄這*初2min內動物的凝滯（freezing）時間作基線。
3．接著加入卡嗒聲，80Db,30s(B相)。
4．緊接著再給予電擊，0.35mA，2s（C相），完成一輪訓練。如需要多輪訓練，則重複A、B、C三相訓練即可。
5．記錄整個訓練階段動物凝滯時間（s），用以測量動物的非條件恐懼（unconditioned fear）。
6．將大鼠移開操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液徹底清潔操作箱，以備進行下一批動物的訓練。
（二）測試階段  在訓練後的**天進行，包括關聯（context）測試、變更關聯（alteredcontext）或條件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）測試以及條件刺激（conditioningstimulus，CS）測試。測試階段冇有電擊刺激。關聯測試和變更關聯測試中也冇有聽覺條件刺激，但每隻動物所用的操作箱應與訓練階段的相同。
1．關聯測試 將動物放入箱內，計算機自動記錄動物的凝滯行為。若用人工觀察，則觀察者（應不知道動物的處理或基因型）用靜聲秒表通過箱門上的貓眼（小窗口）觀察動物的行為並計分：凝滯為1分，活動（moving）為0分（也有隻記錄凝滯時間）。每10秒觀察一次，共5min，這樣可記錄到30次（bout）可能的凝滯（即*大凝滯得分為30分）。用在這一階段記錄到的、動物在同一操作箱內的凝滯時間測量動物的關聯條件恐懼（contextuallyconditioned fear）。此為關聯測試。觀察結束後將動物放回籠內，清潔操作箱，進行下一隻動物的觀察。
2．變更關聯測試和聽覺條件刺激測試  關聯測試1h後進行。操作如下：
（1）將計算機調至所需程序。
（2）操作箱進行如下改造：1用平滑塑料板取代關聯條件箱內的格柵地板；2在箱的對角線加一塊有色塑料板，這樣將長方體的操作箱變成三角體；3改變嗅覺暗示（olfactorycues）。例如，可在箱的一角放一個裝有一滴桔子汁或檸檬汁的杯子，或直接將一滴果汁塗於牆上。然後開始變更關聯和聽覺條件刺激實驗。
（3）將動物放入經改造後的關聯箱（從關聯實驗中的**隻動物開始）。
（4）啟動預置的實驗程序，每隔10秒記錄動物的凝滯和非凝滯得分（分彆為1和0分），共記錄3min，即18次可能的凝滯記錄（凝滯得分為18）。
（5）加入聽覺條件刺激30秒。重複上述記錄3分鐘。
（6）將動物放回籠子，清潔操作箱，進行下一隻動物的測試。
 
二、結果計算與分析
因為不同類型的學習凝滯時間不同，所以*常使用百分計：
關聯=（關聯測試中的凝滯得分/30）*100%
變更關聯（條件刺激前）=（變更關聯中的凝滯得分/18）*100%
聽覺暗示（條件刺激）=（聽覺條件刺激中凝滯得分/18）*100%
對每一不同的凝滯測試計分進行重複測量單因素方差分析（ANOVA），從此比較關聯和變更關聯或聽覺暗示之間的條件恐懼程度，並確定組間差異。一般而言，動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關聯測試的多。在變更關聯測試中，由於關聯條件箱已被改造得“麵目全非”，訓練時動物獲得的對周圍環境的關聯幾乎不存在，因此，凝滯行為應該*少。關聯與變更關聯差彆很大，凝滯計分差彆越大。
 如果動物在**天的關聯測試和聽覺暗示測試中出現凝滯，而在變更關聯測試中不表現凝滯行為，則可認定：動物的感覺和運動功能均正常；能記住前**與厭惡刺激配對出現的暗示信號；能分辨前**不與厭惡刺激配對出現的暗示信號，說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱，提示調節記憶情感部分的神經解剖、神經遞質和基因可能發生變化。
 
三、注意事項
1．動物對電擊的反應部分地取決於非條件刺激的電擊強度和痛#。當動物（尤其是基因改變的動物，如轉基因或基因敲除小鼠）不能學會關聯條件反射時，可能是電擊強度不夠或痛#偏高所致。對條件反應程度與電擊強度進行比較分析，可排除對電擊強度因素的疑慮；對刺激電流強度（0.1~0.7mA）與反應作一“量-效曲線”，可評價動物的痛#或對電擊的敏感性。此外，格柵地板若沾有動物的排泄物也可改變電刺激強度。因此，應保持格柵地板的清潔與乾燥。
2．由於老年動物聽力減弱甚至喪失，對聽覺暗示可能反應遲鈍或無反應。此外，有些品係的小鼠，即使在成年早期，對高頻音刺激的反應尤其減弱。因此，用這一模型測定老年動物或某些品係的小鼠時應特彆謹慎，並避免用高頻音刺激。
3．要使動物在關聯測試中表現凝滯行為，必須讓其在操作箱內有適當的時間。應避免將動物放入箱內便立即給予電刺激，因為這樣動物冇有時間在電擊與箱內環境（關聯）之間形成聯係。
4．觀察者必須快速、準確地判定動物是否表現凝滯行為，而不應在整個10s觀察期間死盯著動物，以免動物在這10s間隙活動而導致計分不準。不同觀察者應用同一種方法計分，兩名觀察者計分之間的相關係數應在0.98以上。同樣地，當采用自動計分係統進行計分時，應對係統進行調節，使之與人工方法計分相比，兩者的相關係數在0.98~1之間。
5．在本實驗中，先測試關聯學習，再測試暗示條件反應。在關聯測試中冇有聽覺暗示刺激，因此，動物在暗示條件測試時對聽覺刺激的反應有可能發生消退（extinction）。理論上，這種聽覺暗示反應可能減弱。為消除這種實驗偏差，將其中一半動物先測試聽覺暗示反應，一小時後再檢查關聯條件反應。
6．實驗分兩天進行。訓練和測試應在每天的同一時間進行。測試（凝滯計分）所花的時間比訓練要長的多，因此，同一批訓練的動物不宜過多。
7．暗示和關聯兩種條件恐懼可表現出發育差異和基因差異。例如，年齡在18天的大鼠有聽覺條件恐懼，但極少有關聯條件恐懼；而到23天時，關聯和聽覺暗示條件恐懼都有。有些品係的小鼠（如DBA/2小鼠）隻有很弱的關聯條件恐懼，但聽覺條件恐懼卻很好。
8．對有些基因型動物，如果預先讓其短暫適應關聯條件，關聯學習會得到改善。一般認為這與海馬功能增強有關。這種適應通常在訓練前**進行，而且時間很短（30~60s）。
9．暗示條件恐懼由側杏仁核調節，而關聯條件恐懼由杏仁核和海馬共同介導。毀損這些腦區可削弱或阻斷暗示與關聯恐懼條件反射。