文章详情
神经科**动物模型的制作经验方法交流
日期：2025-06-16 11:53
浏览次数：2393
摘要：
神经科**动物模型的制作经验方法交流
大家在科研实验中经常涉及到动物模型的制作，望大家将这方面文献以及经验进行交流。
脑缺血模型的制作：
制作脑缺血动物模型的方法很多，但常用方法主要有结扎法和栓塞法两种，结扎法是运用外科手段结扎脑的供血动脉，中止脑的血氧供应，它可以进一步分为颅内结扎和颅外结扎。颅外结扎主要是用于制作全脑缺血模型，可进一步分为①4血管结扎，即结扎颈总动脉/颈内动脉和椎动脉；②2血管结扎，即结扎两侧颈总/颈内动脉，同时抽取动物一定量的血液，使血压降低到50mmHg以下，达到造成全脑缺血的目的。这种方法因为需要监视和控制血压，实验条件要求严格，且因椎动脉未予结扎，往往造成的脑缺血是不完全的。另一种两血管结扎法是用沙土鼠（Gerbil）进行，利用沙土鼠脑底Willis动脉环发育不全后交通动脉缺如的特点，结扎两侧的颈总或颈内动脉造成前脑缺血。栓塞法是用自体血凝块、塑料或玻璃微球来栓塞实验动物颈动脉、脑内大动脉或微动脉，造成脑组织缺血模型，该法简便易行，但可控性、可重复性差，且不能再灌流。
1. 实验动物
实验动物的选择对脑缺血模型是非常重要的，理论上兔、猫、狗和灵长类都可被用来制作脑缺血模型，但更多的人倾向于选择使用鼠作实验。这主要是基于如下认识：因为鼠是小动物，价格便宜，躯体小，消耗药品试剂较少；鼠的脑血管解剖和生理与**动物无明显差异；一些在体的实验操作更容易进行，甚至在伦理学上更容易接受等等。
2. 仪器和设备
制作脑缺血动物模型的仪器设备分为二类：一类是为动物手术服务，包括一套手术器械，手术显微镜，颅钻，脑立体定位仪，温度控制装置（控温仪、红外线灯和加热垫），呼吸机；另一类是用于监测和分析的仪器，包括脑电记录装置，血压记录装置，多谱勒血流记录仪，血气血糖分析仪。
3. 四血管结扎脑缺血模型的制作
这是一个广泛应用的脑缺血模型。*常用的为Pulsinelli的改良方法。该模型选用Wistar大鼠，可以在清醒和自由运动状态下制作严重的脑缺血和恒定的病理学改变。该模型分二个阶段制作，**阶段：将动物麻醉，按置在脑立体定位仪上，调节耳杆和门齿高度使鼠头前倾约30度，同时用橡皮栓住鼠尾给以轻度的牵拉力，使颈椎伸直，翼孔呈水平位，便于观察。枕骨下**颈椎水平正中切口，仔细分离两侧**颈椎横突，暴露**颈椎横突上的翼孔，翼孔下有两则椎动脉通过，用小的单极或双极电凝器插入翼孔烧灼闭塞双侧椎动脉。然后动物取背位，颈部正中切口，分离颈动脉鞘，注意不要损伤迷走神经和颈动脉鞘后方的颈交感干。用外科缝线套住两侧颈总动脉（不要结扎），将线头藏于皮下，简单关闭切口；**阶段：待动物麻醉清醒后自由饮水，但禁食12～24小时后，将动物于清醒状态下，取背位，分别用绳子固定四肢和门齿，以控制动物挣扎。小心分离颈前部的切口，辩认套在颈总动脉上的缝线，轻轻牵起，将线套收紧或者用微血管夹夹闭双侧颈总动脉。此时在2～3秒钟内大鼠将昏迷并丧失对光反射。缺血后2～3分钟可出现异常脑电图，并持续到缺血结束。颈总动脉的关闭时间根据实验设计而定，通常取10～20分钟。昏迷和反射消失是缺血是否成功的标志。据统计约有四分之三的大鼠经上述二阶段处理可导致缺血成功。缺血期间自主呼吸和角膜反射的存在提示脑干血液供应的存在，这是因为脊髓前动脉供血的原因。缺血结束后松开颈总动脉，动物通常很快清醒。但在24～72小时内将有一部分动物出现缺血性抽搐，如果缺血持续30分钟，在24小时内将有20%、72小时有40%的鼠发生缺血性抽搐，这些发生抽搐的鼠在结果分析时应被排除。
约有四分之一的鼠缺血不成功，其中2/3是昏迷不完全，另外1/3死于呼吸衰竭。该模型的制作的关键是烧灼椎动脉，由于椎动脉不能直接看到，这就需要操作者具有一定的经验，适当的掌握烧灼的时间和电极与翼孔的角度，同时要避免损伤脑干。
4.大脑中动脉结扎模型的制作
结扎大脑中动脉（MCA）是制作局灶性脑缺血模型的常用方法，早期大多用较大的实验动物（猫、狗）制作，近年来用大鼠制作的大脑中动脉结扎模型已被大家接受并得到广泛的应用。目前比较标准的模型是Tamura 1981年报道的方法[5]。他们于近侧段结扎SD大鼠的大脑中动脉，并详细比较了结扎后脑血流改变和组织病理学，结果发现结扎后4小时产生较为恒定的纹状体和皮质损害的脑血流（CBF）阈值是25ml/100g/min，这一阈值明显较猫、猴要高。具体操作程序是：动物麻醉下，头皮切口，分离颞肌，取外眦和外耳门连线的中点，用牙科钻或环形颅钻钻开颅骨、暴露大脑中动脉，于手术显微镜下辩认大脑中动脉及其分枝，在分枝的下方即MCA的近段，分离结扎或烧灼MCA，同时取颈部切口分离结扎同侧的颈总动脉。在分离结扎或烧灼MCA时，应避免损伤附近的脑组织，通常用钝头的直角钩子固定于定位仪上，操纵定位仪旋钮，轻轻地将MCA提起，然后烧灼或结扎。该模型操作的关键有两点：(1)**的定位结扎部位，一定要在MCA的豆纹动脉分枝的下方，如果在其上方结扎将很少出现皮质和基底节梗塞灶。但是在实验操作时往往不能辩认出MCA的分支，此时可以嗅沟为标志，在其以下进行结扎；(2)同侧颈总动脉的长久结扎，能够加重MCA供血区的缺血程度，是恒定的脑梗塞出现的必要条件，有时甚至配以暂时的对侧颈总动脉结扎。
该法的优势是病理生理变化接近人类的MCA栓塞，经改进后也可进行重灌流研究。其缺点是开颅破坏了颅内压的恒定，扰乱了脑脊液循环的动力学，并易致**侵入，从而影响组织病理学评价。此外，附着在MCA上交感神经纤维可因结扎或电凝而损伤，使血管的自调节功能受损。
5、脑缺血模型的测量指标
用于脑制备评价的测量指标很多，包括行为学、组织病理学、生物化学、生理学和分子生物学。具体地如何选择评价指标要根据实验者的实验设计，根据实验设计者所要试验的假说来决定。一般的指标有死亡率、神经病学缺失、行为学损害、组织病理学损害等等。1. 死亡率是一个比较简便的指标，在研究**疗效时有一定的作用，但对于脑缺血操作机制的研究所提供的信息非常有限；2. 神经病学缺失的记分方法：这是模拟人类卒中后的临床症状进行评分，但在实际应用中其指标变异太大且客观性不够，应用受到限制。例如大脑中动脉结扎后是否出现运动损害更多的是决定于缺血是否累及内囊而与梗塞灶的大小关系不大。常用大脑中动脉结扎后的神经缺失评价为5级记分法：无神经缺失记为0级；对侧前肢不能充分伸直，显示轻度局灶性神经病缺失记为1级；2级为中度局灶性神经损害，动物向对侧、旋转；显示严重的局灶性神经损害为3级，动物倒向对侧；4级损害是不能自发行走，并伴有不同程度的意识障碍；3. 复杂的行为学指标对评价缺血损伤有一定的作用。如逃避反射的跳台试验、Y型迷宫和Morris水迷宫等，但这类指标要求较高，需对研究人员和实验动物进行专门的训练，花费时间较长。许多研究人员选择更为客观的测量指标，如CBF、脑的糖代谢和组织病理学观察。要注意的是这类指标的脑区间的差异较大，需同时进行多参数分析。在上述指标中评价缺血性损害的金标准（gold standard）是组织病理学观察。例如大脑中动脉结扎后，用脑梗塞灶体积的大小、半影区的大小来评价缺血损害的程度。全脑缺血模型鼠海马CA1区锥体细胞丢失的数量，或者纹状体内神经元死亡的数量来评价全脑一过性缺血损害的程度和某些**的**效果。
脑缺血模型的制作：
制作脑缺血动物模型的方法很多，但常用方法主要有结扎法和栓塞法两种，结扎法是运用外科手段结扎脑的供血动脉，中止脑的血氧供应，它可以进一步分为颅内结扎和颅外结扎。颅外结扎主要是用于制作全脑缺血模型，可进一步分为①4血管结扎，即结扎颈总动脉/颈内动脉和椎动脉；②2血管结扎，即结扎两侧颈总/颈内动脉，同时抽取动物一定量的血液，使血压降低到50mmHg以下，达到造成全脑缺血的目的。这种方法因为需要监视和控制血压，实验条件要求严格，且因椎动脉未予结扎，往往造成的脑缺血是不完全的。另一种两血管结扎法是用沙土鼠（Gerbil）进行，利用沙土鼠脑底Willis动脉环发育不全后交通动脉缺如的特点，结扎两侧的颈总或颈内动脉造成前脑缺血。栓塞法是用自体血凝块、塑料或玻璃微球来栓塞实验动物颈动脉、脑内大动脉或微动脉，造成脑组织缺血模型，该法简便易行，但可控性、可重复性差，且不能再灌流。
1. 实验动物
实验动物的选择对脑缺血模型是非常重要的，理论上兔、猫、狗和灵长类都可被用来制作脑缺血模型，但更多的人倾向于选择使用鼠作实验。这主要是基于如下认识：因为鼠是小动物，价格便宜，躯体小，消耗药品试剂较少；鼠的脑血管解剖和生理与**动物无明显差异；一些在体的实验操作更容易进行，甚至在伦理学上更容易接受等等。
2. 仪器和设备
制作脑缺血动物模型的仪器设备分为二类：一类是为动物手术服务，包括一套手术器械，手术显微镜，颅钻，脑立体定位仪，温度控制装置（控温仪、红外线灯和加热垫），呼吸机；另一类是用于监测和分析的仪器，包括脑电记录装置，血压记录装置，多谱勒血流记录仪，血气血糖分析仪。
3. 四血管结扎脑缺血模型的制作
这是一个广泛应用的脑缺血模型。*常用的为Pulsinelli的改良方法。该模型选用Wistar大鼠，可以在清醒和自由运动状态下制作严重的脑缺血和恒定的病理学改变。该模型分二个阶段制作，**阶段：将动物麻醉，按置在脑立体定位仪上，调节耳杆和门齿高度使鼠头前倾约30度，同时用橡皮栓住鼠尾给以轻度的牵拉力，使颈椎伸直，翼孔呈水平位，便于观察。枕骨下**颈椎水平正中切口，仔细分离两侧**颈椎横突，暴露**颈椎横突上的翼孔，翼孔下有两则椎动脉通过，用小的单极或双极电凝器插入翼孔烧灼闭塞双侧椎动脉。然后动物取背位，颈部正中切口，分离颈动脉鞘，注意不要损伤迷走神经和颈动脉鞘后方的颈交感干。用外科缝线套住两侧颈总动脉（不要结扎），将线头藏于皮下，简单关闭切口；**阶段：待动物麻醉清醒后自由饮水，但禁食12～24小时后，将动物于清醒状态下，取背位，分别用绳子固定四肢和门齿，以控制动物挣扎。小心分离颈前部的切口，辩认套在颈总动脉上的缝线，轻轻牵起，将线套收紧或者用微血管夹夹闭双侧颈总动脉。此时在2～3秒钟内大鼠将昏迷并丧失对光反射。缺血后2～3分钟可出现异常脑电图，并持续到缺血结束。颈总动脉的关闭时间根据实验设计而定，通常取10～20分钟。昏迷和反射消失是缺血是否成功的标志。据统计约有四分之三的大鼠经上述二阶段处理可导致缺血成功。缺血期间自主呼吸和角膜反射的存在提示脑干血液供应的存在，这是因为脊髓前动脉供血的原因。缺血结束后松开颈总动脉，动物通常很快清醒。但在24～72小时内将有一部分动物出现缺血性抽搐，如果缺血持续30分钟，在24小时内将有20%、72小时有40%的鼠发生缺血性抽搐，这些发生抽搐的鼠在结果分析时应被排除。
约有四分之一的鼠缺血不成功，其中2/3是昏迷不完全，另外1/3死于呼吸衰竭。该模型的制作的关键是烧灼椎动脉，由于椎动脉不能直接看到，这就需要操作者具有一定的经验，适当的掌握烧灼的时间和电极与翼孔的角度，同时要避免损伤脑干。
4.大脑中动脉结扎模型的制作
结扎大脑中动脉（MCA）是制作局灶性脑缺血模型的常用方法，早期大多用较大的实验动物（猫、狗）制作，近年来用大鼠制作的大脑中动脉结扎模型已被大家接受并得到广泛的应用。目前比较标准的模型是Tamura 1981年报道的方法[5]。他们于近侧段结扎SD大鼠的大脑中动脉，并详细比较了结扎后脑血流改变和组织病理学，结果发现结扎后4小时产生较为恒定的纹状体和皮质损害的脑血流（CBF）阈值是25ml/100g/min，这一阈值明显较猫、猴要高。具体操作程序是：动物麻醉下，头皮切口，分离颞肌，取外眦和外耳门连线的中点，用牙科钻或环形颅钻钻开颅骨、暴露大脑中动脉，于手术显微镜下辩认大脑中动脉及其分枝，在分枝的下方即MCA的近段，分离结扎或烧灼MCA，同时取颈部切口分离结扎同侧的颈总动脉。在分离结扎或烧灼MCA时，应避免损伤附近的脑组织，通常用钝头的直角钩子固定于定位仪上，操纵定位仪旋钮，轻轻地将MCA提起，然后烧灼或结扎。该模型操作的关键有两点：(1)**的定位结扎部位，一定要在MCA的豆纹动脉分枝的下方，如果在其上方结扎将很少出现皮质和基底节梗塞灶。但是在实验操作时往往不能辩认出MCA的分支，此时可以嗅沟为标志，在其以下进行结扎；(2)同侧颈总动脉的长久结扎，能够加重MCA供血区的缺血程度，是恒定的脑梗塞出现的必要条件，有时甚至配以暂时的对侧颈总动脉结扎。
该法的优势是病理生理变化接近人类的MCA栓塞，经改进后也可进行重灌流研究。其缺点是开颅破坏了颅内压的恒定，扰乱了脑脊液循环的动力学，并易致**侵入，从而影响组织病理学评价。此外，附着在MCA上交感神经纤维可因结扎或电凝而损伤，使血管的自调节功能受损。
5、脑缺血模型的测量指标
用于脑制备评价的测量指标很多，包括行为学、组织病理学、生物化学、生理学和分子生物学。具体地如何选择评价指标要根据实验者的实验设计，根据实验设计者所要试验的假说来决定。一般的指标有死亡率、神经病学缺失、行为学损害、组织病理学损害等等。1. 死亡率是一个比较简便的指标，在研究**疗效时有一定的作用，但对于脑缺血操作机制的研究所提供的信息非常有限；2. 神经病学缺失的记分方法：这是模拟人类卒中后的临床症状进行评分，但在实际应用中其指标变异太大且客观性不够，应用受到限制。例如大脑中动脉结扎后是否出现运动损害更多的是决定于缺血是否累及内囊而与梗塞灶的大小关系不大。常用大脑中动脉结扎后的神经缺失评价为5级记分法：无神经缺失记为0级；对侧前肢不能充分伸直，显示轻度局灶性神经病缺失记为1级；2级为中度局灶性神经损害，动物向对侧、旋转；显示严重的局灶性神经损害为3级，动物倒向对侧；4级损害是不能自发行走，并伴有不同程度的意识障碍；3. 复杂的行为学指标对评价缺血损伤有一定的作用。如逃避反射的跳台试验、Y型迷宫和Morris水迷宫等，但这类指标要求较高，需对研究人员和实验动物进行专门的训练，花费时间较长。许多研究人员选择更为客观的测量指标，如CBF、脑的糖代谢和组织病理学观察。要注意的是这类指标的脑区间的差异较大，需同时进行多参数分析。在上述指标中评价缺血性损害的金标准（gold standard）是组织病理学观察。例如大脑中动脉结扎后，用脑梗塞灶体积的大小、半影区的大小来评价缺血损害的程度。全脑缺血模型鼠海马CA1区锥体细胞丢失的数量，或者纹状体内神经元死亡的数量来评价全脑一过性缺血损害的程度和某些**的**效果。
