急性*大电休克和慢性经耳电点燃癫痫对大鼠学习和记忆的影响
[摘 要] 目的: 探讨急性*大电休克和慢性经耳电点燃癫痫对大鼠学习和记忆的影响。方法: 通过双耳夹给予大鼠电刺激(150mA, 0. 2 s)诱发急性*大电休克(M ES), 而慢性经耳电点燃癫痫,是经双耳夹每24h给予大鼠一次亚惊厥剂量电刺激(40mA, 0. 2 s)直至完全点燃。采用八臂迷宫(四臂放饵)研究大鼠空间学习能力和记忆再现能力。高效液相色谱分析法(H PL C)检测脑中组胺、C2氨基丁酸(GA BA)、谷氨酸的含量变化。结果: 在学习过程中, 与对照组相比, 急性*大电休克仅增加了学习过程中的参考记忆错误次数, 同时使大鼠海马内GA BA含量增加。而慢性经耳电点燃癫痫在空间记忆再现过程中, 大鼠工作记忆和参考记忆错误次数增加并且在完全点燃后持续近3周。慢性经耳电点燃癫痫大鼠在完全点燃24h后海马CA1区神经元发生退行性变化, 同时使大鼠海马组胺含量减少。结论: 不同种癫痫对认知功能的影响不同: (1)急性*大电休克损伤了空间学习能力, 可能与异常的突触可塑性及海马内的GA BA含量上升有关; (2)慢性经耳电点燃癫痫诱发了空间记忆再现障碍, 可能与海马CA1区神经元的病理改变及海马内组胺含量的下降有关。
[关键词] 癫痫ö病理生理学; 记忆障碍ö病因学; 参考记忆; 工作记忆; 动物, 实验
癫痫是一种常见病, 其发病率为0. 5% ,癫痫所造成的危害不仅在于癫痫发作本身, 还在
于反复发作的慢性癫痫所致的学习记忆障碍等认知和行为异常。普 遍 认 为, 癫 痫 影 响 了 认 知 功 能。Sa rk isian等报道, 单纯的海人藻酸注射引起了癫痫状态的持续发作, 同时也导致了严重的组织缺损和记忆障碍。慢性戊四唑化学点燃引起组胺活性下降, 同时导致了空间记忆障碍。然而, 关于癫痫和认知也有不同的甚至相反的报道, 慢性癫痫虽然不同程度地影响了认知的形成和维持, 但癫痫对认知功能的作用并不都是负面的。例如, 杏仁核点燃大鼠在空间学习和社交关系实验中显示与正常对照组无明显差异, 急性*大电休克(M ES)对被动回避反应没有明显的影响。我们的前期实验中建立了慢性经耳电点燃癫痫的大发作模型, 并发现可导致大鼠被动回避反应记忆保持能力的下降。本实验拟利用放射状八臂迷宫, 测定急性M ES和慢性经耳电点燃癫痫对大鼠空间学习和记忆的影响。
1 材料和方法
1. 1 动物和分组 SD 大鼠180只, 雄性, 体重220～270g(浙江大学医学院实验动物中心提
供, 清洁级Ê级, 证书号: 2229601018)。随机将大鼠分成急性M ES组、慢性经耳电点燃癫痫
组、对照组, 每组又分成学习组和记忆再现组,每组30只大鼠。每只大鼠每天12h的光照ö12
h黑暗。温度(22～26℃)、湿度(40%～70%),自由饮水, 在整个实验过程中限制进食, 保持体
重为自由进食体重的80%～85% ,行为学实验安排在10: 00～17: 00进行。
1. 2 急性M ES模型 用德国H ugoSach s电刺激器(H ugoSach sT yp e221,F re ibu rg), 经双
耳夹电极仅给予1次50H z的方波脉冲、150mA、0. 2 s刺激诱发全身强直阵挛发作。如果出现后肢强直性伸展(即后肢伸展程度与身体平行)则为标准的*大电休克(M ES)。
1. 3 慢性经耳电点燃模型 每日用鳄鱼夹夹大鼠双耳, 给予阈下电刺激(40mA, 0. 2 s), 24
h1次。对照组给予鳄鱼夹夹大鼠双耳但无电流通过。每次刺激后观察行为变化, 同时记
录是否出现后肢强直性伸展(HL E)。若动物连续3次电刺激后均出现后肢强直性伸展, 则认
为完全点燃。本实验中所有慢性经耳点燃大鼠在连续刺激7～10d后均完全点燃。
1. 4 放射状八臂迷宫学习获得和记忆再现测试 如前所述, 放射状八臂迷宫中央区直径
30cm, 向四周以等角度和等长度延伸八条臂(50cm×12cm)。迷宫高出地面40cm。迷宫周
围布置各种东西作为参照物。每次训练、测试过程中, 八臂中只有四臂放置食饵(分别为3、5、6和8号臂)。
1. 4. 1 放射状八臂迷宫学习过程测试: 大鼠经急性M ES或慢性经耳电点燃24h后, 开始放射状八臂迷宫学习。在学习前大鼠先在迷宫中适应2天, 每天1次。适应时3～4只大鼠同时置于迷宫中, 自由活动和摄取饵10m in。适应后进行每天1次的训练。大鼠放在迷宫中央区, 此时中央区四周用门关住, 15 s后, 门开放, 大鼠可选择进入任意一臂, 以摄取食饵。大鼠进入有饵的臂且摄取了饵为一次正确选择, 否则为错误选择。记录参数为错误选择的次数。重新进入放食饵臂称为工作记忆错误(w o rk ingm em o rye r ro r,WM E), **次进入不放食饵臂称为参考记忆错误(refe rencem em o rye r ro r,RM E)。
1. 4. 2 记忆再现过程: 再现组大鼠同上方法,先进行迷宫训练, 连续5次训练总错误选择次
数为1次或1次以下, 认为训练成功。然后给予慢性经耳电点燃和急性M ES, 至完全点燃24h后或急性M ES(前几天如对照组给予鳄鱼夹夹大鼠双耳但无电流通过, *后**再给予M ES)24h后及第7、11、14、18、21、28、31天, 在同一八臂迷宫测记忆的再现过程, 整个测定过程参照物体和放食饵臂同训练过程一致。
1. 5 脑内组胺、GA BA和谷氨酸含量的测定 大鼠在给予M ES或完全点燃24h后,
M ES组、点燃组和对照组分别取6只大鼠, 用过量水合氯醛麻醉后, 断头取脑, 置于不锈钢板上(不锈钢板下有冰), 依次取出皮层、海马组织, 储存在- 80℃冰箱里备测。将脑组织置于含有3%高 氯 酸、5mm o löL 乙 二 胺 四 乙 酸 钠(ED TA)和52氢2N2X甲基色胺的溶液中, 在冰浴下匀浆, 然后在- 4℃环境温度下离心20m in(15000g)。取上清, 用0. 22 Lm的二氟聚乙二烯膜滤过。采用本实验室自行设计的高效液相色谱法(H PL C)结合电化学检测技术检测样品中组胺、GA BA及谷氨酸含量。整个系统由582泵、542自动进样器、四通道的Co u lA r ray电化学探测器组成。用Co u lA r ray○R软件控制系统作数据收集和分析。
1. 6 海马病理切片 大鼠在给予M ES或完全点燃24h后, 过量水合氯醛麻醉, 从主动脉灌
注生理盐水200m l, 然后4%多聚甲醛溶液200m l灌注, 灌注结束后立即取脑, 室温下置4%多聚甲醛溶液及30%蔗糖溶液中至少1周。行冠状冰冻切片, 片厚12Lm。切片以苏木精和伊红染色、封片(H E染色)。在显微镜下观察海马CA1区锥体细胞形态。
1. 7 统 计 学 处 理 采 用SP SS 11. 5 fo rW indow s统计学软件进行数据的分析处理。数据均采用xq±sxq表示。组间比较如方差齐性, 采用单因素方差分析和D unne t t’s 检验, 方差不齐则采用K ru ska l2W a llisH检验和D unn’s检验。
