热休克蛋白抑制慢性心理应激引起的焦虑样行为增加

【摘要】 目的: 采用 HSF1 基因敲除小鼠模型探讨热休克蛋白( heat shock protein, HSP)对慢性心理应激引起的焦虑
样行为增加的抑制作用。方法: 将热休克因子 1(heat shock factor 1)基因野生型小鼠(HSF1+/+)和热休克因子 1 基因敲
除小鼠(HSF1- /- )暴露于 2 个月的慢性心理应激, 部分小鼠在暴露于慢性心理应激前给予热休克预处理, 2 个月后采
用高架十字迷宫和旷场实验检测各组小鼠焦虑样行为,western blots 检测和比较 HSP72,HSC70 表达, 采用多因素析
因设计方差分析对各组小鼠焦虑样行为进行比较。结果:慢性心理应激引起焦虑样行为增加, HSF1 基因敲除导致焦
虑样行为增加更加明显。热休克预处理使野生型小鼠海马组织中 HSP70, HSC70 明显升高, 并明显减轻了心理应激
所致的焦虑样行为的增加。 HSF1 基因敲除废除了热休克所致的 HSP 诱导表达及其对心理应激所致焦虑样行为增加
的抑制作用。结论: 诱导型 HSP 在抑制心理应激引起的焦虑样行为增加中起着重要的作用。
【关键词】 热休克蛋白; 热休克因子 1; 心理应激; 焦虑; 高架十字迷宫; 旷场
中图分类号: R395.9 文献标识码: A 文章编号: 1005- 3611(2006)06- 0655- 04
Use of HSF1- /- Mice to Reveal a Role of HSP in Decr easing Anxiety
Caused by Chronic Psychological Str ess
PENG Min, YAO Shu- qiao, ZHU Xiong- zhao, CHENG Ming
Medical Psychological Research Center, 2nd Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China
【Abstr act】 Objective: To investigate the potential involvement of HSP in chronic psychological stress- induced anxiety-
like behaviour. Methods: HSF1+/+ and HSF1- /- mice were submitted to chronic psychological stress and heat shock pre-
treatment for 2 months. Anxiety- like behaviour of mice was assessed by elevated- plus maze and open field; expression of
HSP72, HSC70 was detected by western blots. 3- way ANOVA was used to analyse the anxiety- like behaviour of each
group. Results: Chronic psychological stress caused a significant increase in anxiety- like behavior. Heat shock pretreat-
ment increased the expression of HSP72, HSC70 and decreased anxiety- like behavior in HSF1+/+ mice, HSF1 knock out
abolished inducible expression of HSP70, HSC70 and their protective effects against chronic psychological stress induced
increase of anxiety- like behavior. Conclusion: Inducible heat proteins play an important role in relieving the anxiety- like
behaviour induced by chronic psychological stress.
【Key words】 Psychological stress; Heat shock pretreatment; HSP; Anxiety- like behaviour; Hippocampus; Elevated
plus maze
慢性心理应激, 如空间狭小、 拥挤、 工作压力、 遭
遇负性生活事件等等, 可以引起焦虑增加[1]
, 所涉及
到的脑区包括海马、 杏仁核、 下丘脑、 扣带回等等。 慢
性心理应激诱发焦虑的机制并不完全清楚, 目前的
研究认为, 谷氨酸可能在其中起着重要作用[2]
: 心理
应激引起糖皮质**(GC)增加, 进而引起海马谷氨
酸过度增加[3]
, 由于谷氨酸在许多精神障碍的发病
中发挥关键作用, 谷氨酸可以引发其他神经递质如
NE、 5- HT、 DA的异常[4]
, 引起一系列神经递质失衡,
焦虑程度增加。
大量研究表明: 热休克反应 ( heat shock reac-
tion, HSR) 可 以 激 活 HSF1 ( heat shock factor 1,
HSF1) , 从而诱导热休克蛋白 ( heat shock protein,
HSP)表达增加, HSP72 表达增加可以对抗谷氨酸兴
奋性毒性[5, 6]
, 稳定细胞结构。但是 HSP72 这一对抗
谷氨酸兴奋性毒性的作用是否有利于对抗心理应激
引起的焦虑增加并不清楚。 因此, 本研究探讨热休克
预处理以及 HSP 在心理应激过程中是否具有对抗
焦虑的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
本实验动物来自美国德克萨斯大学西南医学实
验中心培育的 HSF1 基因敲除杂合子进行繁殖得来
的野生型小鼠(基因型为: HSF1+/+, 简称 HSF1+/+小
鼠)和 HSF1 基因敲除的纯合子(基因型为: HSF1- /
- , 简称 HSF1- /- 小鼠) , 其族系为 129 小鼠的 ES 细
胞与 Balb/c 形成的嵌合体, 在中南大学湘雅医学院
动物实验中心进行近亲繁殖, 经 PCR 基因型鉴定,
在中南大学湘雅二院动物实验中心饲养 (实验室达
二级标准, 湖南省实验动物组委会认证, 证书号
028)。全价营养饲料, 清洁级条件。垫料及水均严格
中国临床心理学杂志 2006 年 第 14 卷 第 6期 ·655·**, 光照 8AM- 8PM, 室温 24± 0.5℃, 相对湿度
60%, 照度 220lux。
6- 7 月龄小鼠经行为观察剔除行为表现极端的
小鼠后, 共选取 76 只进入实验, 其中 HSF1+/+小鼠
共 40 只, 随机分为四组: 对照组( non experimental
stress group,简称 NS 组) 12 只, 不给予实验应激; 心
理应激组( psychological stress group,简称 PS 组) 12
只, 给予心理应激; 热休克预处理组( heat shock pre-
treatment group, 简称 HS组) 6 只, 给予热休克预处
理; 热休克预处理加心理应激组 ( heat shock pre-
treatment+psychological stress,简称 HS+PS组) 10 只,
给予热休克预处理和心理应激。HSF1- /- 小鼠共 36
只, 同样分为 NS组 12 只, HS 组 8 只, PS 组 6 只,
HS+PS组 10 只, 分别接受与相对应的 HSF1+/+小鼠
各组同样的处理 (实验过程中死亡的小鼠未记在
内)。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备 ①热休克预处理[7]
: 采用自制的加
热装置, 将肛温温度计插入小鼠**约 1- 2cm处,
加热使肛温达 42° C, 温度维持约 15 分钟, 湿度约
40%。热休克预处理每周 2 次, 于周一和周四给予。
②心理应激: 心理应激包括限制应激, 高台应激和旁
观电击应激。(1)限制应激[8]
: 将小鼠置于自制的不透
明塑料小瓶中(直径 4cm, 长 8cm) , 留有透气口, 小
瓶刚好可容纳 1 只小鼠, 但无法在里面自由活动。 限
制应激每周 2 次, 每次 1 小时。(2)高台应激[9]
: 把实
验小鼠放置在一个 10× 10 厘米, 高 1.6 米的平台上,
平台放置在光线良好的房间的中央, 高台应激每周
2 次, 每次 1 小时, 由于小鼠恐高, 通过这种方法可
以造成动物的心理应激。 (3)旁观电击应激[10]
: 旁观电
击的电击箱被分成九个小格, 格子之间通过透明的
带孔树脂板隔开, 底板为导电的铁丝, 外周的 8 小格
底板上垫有玻璃板, 中央格底板上不垫有玻璃板。 实
验时, 躯体应激的小鼠放在中央格中, 接受心理应激
的小鼠放在外周格中。通过电击发生器对中央格的
小鼠进行无规律的间歇性足底电击刺激, 外周格的
小鼠没有遭受电击, 但能通过视觉、 听觉、 以及嗅觉
系统接收来自电击小鼠组的信息, 引起心理应激。 旁
观电击每周 2 次, 每次 1 小时, 电击每次持续 5 秒,
频率为每分钟 1 次。
1.2.2 焦虑样行为评定 各组动物在给予相应的应
激两个月后, 对其焦虑样行为进行观察, 包括高架十
字迷宫和旷场。①高架十字迷宫[11]
: 包括两条开臂
( 50cm× 10cm)和两条闭臂( 50cm× 10cm× 40cm) , 由中
央区( 10cm× 10cm)连接。十字迷宫离地面 50cm。测
量时室内暗光。 小鼠从中央格面向开臂放入迷宫, 记
录 5 分钟内的活动情况。 观察指标包括: 闭合臂进入
次数(必须有两只前爪进入臂内) ; 开放臂进入次数;
闭合臂停留时间; 开放臂停留时间。②旷场[12]
: 木制
箱 100cm× 100cm× 100cm, 底板用笔划成 25 个方格
20cm× 20cm, 沿墙格称外周格, 其余为中央格, 将动
物放在正中央格, 观察 5 分钟内爬行的总格数, 三爪
以上跨入邻格才能计数。
1.2.3 组织收集 各组动物在 2 个月慢性心理应激
后, 行为观察 24 小时后断头处死。开颅后迅速于冰
上取出脑组织, 剥出海马, PBS 中洗去血液, 液氮中
速冻并保存备用。
1.2.4 提取蛋白和 western- blots 取出冻存海马,
液氮中研磨成粉末后, 经 4° C预冷 PBS洗 3 次, 加
入细胞裂解液裂解提取海马组织总蛋白, 紫外分光
光度法定量总蛋白量,以相同体积的 15ug总蛋白量
上样, 经 10%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白
质, 电泳完毕后, 60V 的电压 12h 转移于 PVDF 膜
上。BSA 37℃封闭 2h; 一抗 ( 1: 1000, stressgen) 4° C
静置孵育过夜, TBS- T 漂洗 3 次× 10min; 加入 1∶
2000 稀释的二抗,室温摇床摇 1h; TBS- T漂洗 3 次×
10min; DAB显色, 全自动图像分析系统进行光密度
指数分析。
2 结 果
2.1 焦虑样行为评定
2.1.1 开臂停留时间比例 HSF1 基因, 热休克预处
理, 心理应激对小鼠在高架十字迷宫中开臂停留时
间的影响见表 1。三因素析因设计的方差分析结果
表明: 对开臂停留时间的影响, 心理应激具有主效应
( F1,76=127.63, P=0.000<0.05) , 热休克预处理具有
边缘效应( F1,76=3.419, P=0.069) ,基因与心理应激
具有一阶交互作用( F1,76=19.13, P=0.000<0.05) , 基
因与热休克预处理, 心理应激具有二阶交互作用
( F1,76=7.63, P=0.007<0.05)。对基因与心理应激的
一阶交互作用做简单效应分析, 发现无论在 HSF1- /
- 小鼠 ( P=0.001<0.05) 还是在 HSF1+/+小鼠 ( P=
0.035<0.05) , 心理应激都引起开臂停留时间减少。
基因与热休克预处理, 心理应激的二阶交互作用作
简单简单效应分析, 结果发现, 热休克预处理在没有
心理应激的时候, 不影响 HSF1+/+( P=0.268>0.05)小
鼠和 HSF1- /- ( P=0.149>0.05)小鼠的开臂停留时间。
在有心理应激的时候, 在 HSF1- /- 小鼠中, 热休克预
处理对心理应激引起的开臂停留时间减少没有影响
( P=0.208>0.05) , 而在 HSF1+/+小鼠中, 热休克预处
理可以阻止心理应激引起的开臂停留时间减少( P=
0.026<0.05)。
2.1.2 开臂进入次数比 HSF1 基因, 热休克预处
理, 心理应激对小鼠在高架十字迷宫中开臂进入次
·656· Chinese Journal of Clinical Psychology Vol.14 No.6 2006数比的影响见表 2。三因素析因设计的方差分析结
果表明: 对开臂进入次数比的影响, 心理应激具有主
效应( F1,76=8.44, P=0.005<0.05) ,基因与心理应激
具有一阶交互作用( F1,76=8.92, P=0.004<0.05)。对
基因与心理应激的一阶交互作用做简单效应分析,
发现在 HSF1- /- 小鼠中, 心理应激可以引起开臂进
入次数比明显减少( P=0.000<0.05) , 而在 HSF1+/+小
鼠中心理应激没有引起开臂进入次数比减少 ( P=
0.973>0.05)。
表 1 各组小鼠高架十字迷宫中开臂停留时间
比例的比较 (x± s )
注: *P<0.05 vs NS, HS; **P<0.05 vs PS; 下同。
表 2 各组小鼠高架十字迷宫中开臂进入次数
比例的比较 (x± s )
2.1.3 旷场总格数 HSF1 基因, 热休克预处理, 心
理应激对小鼠旷场总爬行格数的影响见表 3。三因
素析因设计的方差分析结果表明: 对旷场总爬行格
数的影响, 基因具有主效应 ( F1,76=145.34, P=
0.000<0.05) , 心理应激具有主效应( F1,76=70.48,P=
0.000<0.05) , 基因与热休克预处理具有一阶交互作
用( F1,76=7.52, P=0.008<0.05) , 对基因与热休克预
处理的一阶交互作用做简单效应分析, 发现在
HSF1- /- 小鼠中, 热休克预处理引起旷场总爬行格
数明显减少( P=0.000<0.05) , 而在 HSF1+/+小鼠中热
休克预处理没有引起旷场总爬行格数减少 ( P=
0.730>0.05)。
表 3 各组小鼠旷场总爬行格数的比较 (x± s )
2.2 蛋白质表达
2.2.1 HSP72 表达 Western 印迹分析法检测海马
内 HSP72 的表达, Western blot 图片全自动图像分
析系统进行光密度指数分析和统计学分析。结果显
示, HSF1+/+小鼠各组内均见 HSP72 表达, 其中 HS
组和 HS+PS 组 HSP72 表达明显高于 NS 组 ( P<
0.05) , 心理应激也引起 HSF1+/+小鼠 PS 组海马内
HSP72 表达显著增加( P<0.05) , 而 HSF1- /- 各组小
鼠几乎未检测到 HSP72 表达, 仅 HS+PS 组有少量
HSP72 表达, 但其表达显著低于 HSF1+/+小鼠。
2.2.2 HSC70 表达 HSF1+/+和 HSF1- /- 各组小鼠
均见 HSC70 组成型表达, Western blot 图片经全自
动图像分析系统进行光密度指数分析和统计学分
析, 结果显示: 热休克预处理( 42o
C 15 分钟)可以
引起 HSF1+/+小鼠和 HSF1- /- 小鼠的在 HS 组和
HS+PS 组的海马内 HSC70 表达增加 ( P<0.05) , 但
HSC70 表达在 HSF1- /- 各组小鼠显著低于相应的
HSF1+/+小鼠。
3 讨 论
本研究结果显示, 给予心理应激后, HSF1- /- 小
鼠和 HSF1+/+小鼠开臂停留时间比例减少, 开臂进
入次数比例减少, 旷场总探索格数减少, 提示心理应
激引起焦虑样行为增加, 这与既往的研究相符合[1]
。
而热休克预处理可以阻止 HSF1+/+小鼠中心理应激
引起的开臂停留时间减少, 提示热休克预处理可以
缓解 HSF1+/+小鼠中心理应激引起的焦虑增加。这
一保护作用只存在于 HSF1+/+小鼠中, 而在 HSF1- /
- 小鼠中并不具有这一保护作用, 提示这一保护作
用是由热休克通过激活 HSF1 而调节与机体保护有
关的信号旁路而达到的。 对旷场总爬行格数分析, 心
理应激引起 HSF1+/+小鼠和 HSF1- /- 小鼠旷场总爬
行格数减少, 在两种基因型鼠中, 热休克预处理没有
抑制心理应激引起的旷场总爬行格数减少, 没有减
少焦虑样行为; 但是在 HSF1- /- 小鼠中, 热休克预处
理不但没有表现出保护作用, 反而引起旷场总爬行
格数进一步减少, 增加了焦虑样行为, 进一步说明了
热休克的保护作用必须通过 HSF1 的介导才能实
现, 若没有 HSF1 的存在, 热休克反而成为一种损害
因素。 对开臂进入次数比例的分析显示, 热休克预处
理没有抑制开臂进入次数比例下降, 没有表现出减
少焦虑样行为的作用。 但是在 HSF1- /-小鼠中, 心理
应激减少开臂进入次数比例, 而在 HSF1+/+小鼠中
心理应激却没有引起开臂进入次数比例降低, 提示
不光热休克可以通过激活 HSF1 而调节与机体保护
有关的信号旁路, 心理应激同样可以通过激活 HSF1
而调节与机体保护有关的信号旁路, 在应激状态下
对机体进行自我保护。
为探讨这一保护作用的机制, 本研究进一步采
用 HSF1+/+小鼠和 HSF1- /-小鼠, 比较在有 HSF1因的情况下, 给予热休克预处理后蛋白质表达的差异, 从而寻找热休克预
处理是如何通过 HSF1 的介导对抗心理应激引起的
焦虑的。结果发现, 在 HSF1+/+小鼠, 热休克预处理
可以诱导 HSP72, HSC70 在 HS 组和 HS+PS 组显著
增加, NS 组和 PS 组也有较多的 HSP72, HSC70 表
达。而 HSF1- /-小鼠由于剔除了 HSF1 基因, 其海马
内 HSP72 表达被大大削弱, 在 NS, HS, PS组几乎检
测不到 HSP72, 只在 HS+PS 组检测到少量 HSP72
表达, HSC70 组成型表达和在热休克预处理下的诱
导型表达也降低。这与热休克预处理抑制 HSF1+/+
小鼠中焦虑样行为的增加, 而无法抑制 HSF1- /- 小
鼠焦虑样行为增加相符合。因此, 上述的结果提示
热休克预处理可以降低心理应激引起的焦虑增加,
这一保护作用是由于热休克通过激活 HSF1 而实现
的, 各种 HSP 大量诱导表达在其中起着重要的作
用。由于既往的研究表明热休克可以调节多条与机
体保护有关的信号旁路, 通过激活 HSF1 而达到的
通路中, 诱导 HSP 表达是其中*一个重要的方面,
另外还包括糖皮质**受体介导的基因表达, 细胞
因子的产生, 因此在热休克过程中, 是否还有其他的
信号通路通过 HSF1 的激活在其中发挥了保护作用
仍需要进一步探讨。
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