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紫河车对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织内β淀粉样蛋白

日期:2020-09-18 16:00
浏览次数:1645
摘要:
【摘要 】   目的   观察用紫河车干预后的阿尔茨海默病 (AD)模型大鼠的脑组织内β样淀粉蛋白 (Aβ)、 β类淀粉前体蛋白信使
核糖核酸 (βAPPmRNA)表达改变 ,探讨紫河车改善阿尔茨海默病模型大鼠症状的部分机制。方法  用 Okadaic acid (OA)注于实验
大鼠脑内杏仁核建立 AD动物模型 ,用避暗法和穿梭箱法测试实验大鼠的学习记忆能力 ,用**组织化学方法显示实验大鼠脑组织
内 Aβ表达的变化 ,用原位杂交方法显示实验大鼠脑组织内βAPPmRNA表达的变化。结果  用紫河车**和预防一段时间后的
AD模型大鼠 ,其学习记忆能力的测试成绩明显优于同时间点模型组大鼠的成绩 ( P < 0105) ,其脑组织内 Aβ、 βAPPmRNA表达数
量也明显少于同时间点模型组大鼠脑组织内的 Aβ、 βAPPmRNA表达数量 ( P < 0105)。结论   经紫河车干预后 ,AD模型大鼠的行
为异常得到改善 ,同时其脑组织内 Aβ、 βAPPmRNA表达也受到抑制。
[关键词 ]  阿尔茨海默病;紫河车;淀粉样β蛋白;淀粉样β蛋白前体
Effect of Ziheche onβ2 amylo id,β2 amylo id precursor prote i n mRNA i n bra i n tissue of ra tmodel of Alzhe i mer’ s d isea se
YUAN M eng2 sh i , CHEN X iang2liang, ZHOU De2 sheng, YANG Q i2 dong . First Affiliated Hos p ital of Hunan University of TCM, Changsha
410007, China
【Abstract】  Objecti ve To observe the changes ofβ2 Amyl oid,β2 Amyl oid p recurs or p r otein mRNA in brain tissue of rat model of
Alzhei mer’ sDisease (AD) after interventi on with Ziheche and investigate the mechanis ms of enhancing learning and memory in ratmodel of
Alzhei mer’ sDisease by Ziheche . Methods The rat model of Alzhei mer’ s diseases was established by stereotaxic injecti on of okadaic acid
(OA) t o one of amygdala comp lexes . The learning and memory ability of the rats was evaluated . The i mmunohist ochemistry was used t o i2
dentify the alterati ons ofβAmyl oid in brain tissue, and the in situs hybridizati on was used t o identify the alterati ons ofβAPP mRNA in brain
tissue . Results After the ratmodel of Alzhei mer disease were treated and p revented with Ziheche, their learning and memory ability was
better than those in ratmodel ofAD without treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) , the exp ressi on ofβAmyl oid, βAPP mRNA in
brain tissue was less than that not treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) . Conclusi on After treated and p revented with Ziheche,
the learning and memory ability of the ratmodel ofAD was enhanced, and the exp ressi on of theβAmyl oid,βAPP mRNA in brain tissue of
the ratmodel ofAD decreased .

【Key words】   Alzhei mer disease; Placenta hominis ;Amyl oid beta2 p r otein;Amyl oid beta2 p r otein p recurs or
   从临床实践中表明阿尔茨海默病 (AD) 无论从
发病机制还是临床表现来看 , 都与肾精亏密切相
关[ 1 ]
。紫河车属于血肉有情之品 , 擅长**填精 , 笔
者拟从动物实验着后来验证其防治 AD的效果及其机
制。β淀粉样蛋白 (β2 Amyl oid, Aβ) 异常沉积是 AD
患者脑组织内老年斑形成的主要原因; 近年来研究表
明β淀粉样前体蛋白 (βAPP) 基因突变是造成 Aβ
异常沉积的关键因素[ ]
。本文研究紫河车干预 Aβ和
βAPPmRNA的表达 , 现报告如下。
1  材料与方法
1·1  动物与分组、分点  选取健康 SD 66只 , 3~4
月龄 , 体重 180~250 g, 清洁级 , 雌雄各半 , 随机分
为模型组、**组、预防组、假手术组、空白组 , 每
组分 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d 5个观察点 , 每个观
察点 3只实验大鼠。
1·2 AD大鼠模型的建立  在脑立体定位仪上 , 用
微量注射器将 OA 1μl (相当于 100 ng) 注入大鼠杏
仁核 (前囟后 2112 mm、矢状缝旁 4 mm, 深 8 mm) ,
10 min左右注射完, 留针 5 min。其中假手术组缓注
射等量的生理盐水。
1·3  实验大鼠的给药  以紫河车生药计 2 g·kg
- 1
·d
- 1
给药。将紫河车加工成极细粉末 , 以 100 ml
水: 25 g紫河车粉末的比例配制成液体 , 给实验大鼠
中给药者灌胃给药。预防组给药: 在造模前 7 d开始给药 , 连续 7 d, 造模后不给药。其他给药组给药:
即**组和假手术组在造模后即开始给药 , 直到其被
取脑制标本。
1·4  行为学观察   按观察目的设定实验大鼠的行为
学观察的时间点。用避暗箱进行被动回避反应测试 ,
分别进行保留试验、获得试验 , 记录测试数据[ 2 ]
。用
穿梭箱进行主动回避反应测试 , 分别进行保留试验、
获得试验 , 记录测试数据[ 3 ]

1·5  脑组织的切片制备   各组常规灌注固定 30 min
后行石蜡切片 , 随机选取海马相邻切片分别作**化
实验和原位杂交实验。
1·6 Aβ的**组化测试  主要步骤: 石蜡切片常
规脱蜡至水 -水浴修复抗原 - PBS洗 -滴加抗原修复
液 - PBS洗 -滴加正常羊血清封闭液 -滴加 -抗 (兔
抗鼠 IgG) 37℃, 30 min至 2 h或者 20℃ 60~120
min, 也可以 4℃ 过夜 (先 37℃, 60 min至 2 h孵育 ,
再 4℃过夜 ) - PBS洗 -滴加生物素化山羊抗兔 IgG
(即二抗 ) , 孵育 20 min - PBS洗 -滴加 S ABC -即三
述两者之间。⑵ 造模后对各组被动逃避反应 “保留 ”
的影响: 模型组对已经获得的对电击的记忆遭到破
坏 , 而假手术组则保留较好 , **组在**一段时间
后 , 对电击记忆恢复比模型组好 , 预防组对电击记忆
在术后短期内比模型组好。
2·2  各组大鼠主动逃避反应行为的测试结果  ⑴造
模后对各组大鼠主动回避反应 “获得 ”的影响: 测
试结果表明模型组的正确回避率*低 , 且在随后的继
续训练中回避反应的正确率增长*慢; 假手术组的正
确回避率高 , 在随后的继续训练中回避反应的正确率
增长快; **组与预防组介于两者之间。⑵造模损伤
后各组大鼠主动逃避反应 “保留 ”的改变: 结果表
明模型组大鼠的主动逃避反应行为的 “保留 ”有严
重损害 , 而假手术组这种表现*轻 , **组在**一
段时间后对主动回避反应的记忆恢复得比模型组好 ,
预防组对主动回避反应的记忆在短期内比模型组好。
2·3 Aβ**组化测试结果  观察经 Aβ**组化
测试后各切片 , 阳性表达细胞的胞浆呈浅棕黄色 , 阳抗 - PBS洗 -滴加 DAB, 室温下 , 背光 (暗室 ) 显
色 5~30 min, 镜下控制反应时间 , 有表达后蒸馏水
洗 5 min /次 × 3以中止反应 -封片 -在显微镜下观察
计数。
1·7  β2 APPmRNA的原位杂交测试  主要步骤 ⑴石
蜡切片经常规脱蜡至水。30% H2O2 1份 +蒸馏水 10
份混合灭活内源性酶 , 胃蛋白酶暴露 mRNA核酸片
段 , 0104%多聚甲醛 /011MPBS (pH 712~716) 后固
定; ⑵ 预杂交: 干杂交盒底部加 20%甘油 20 ml以保
持湿度 , 每张切片加预杂交液 20μl。恒温箱 38~
42℃ 2~4 h。吸取多余液体 , 不洗; ⑶ 杂交: 按每张
切片 20μl杂交液 (β2 APPmRNA探针杂交液 ) 加在
切片上。恒温箱 38~42℃杂交过夜; ⑷杂交后洗涤:
滴加封闭液 37℃ 30 min, 甩去多余液体 , 不洗; ⑸
滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃ 60 min或室温 120
min, 用 PBS洗 5 min × 4。勿用其它缓冲液和蒸馏水
洗涤; ⑹ 染色、封片步骤同**组化。
1·8  统计学处理  使用 SPSS 1110统计软件 , 所有
结果用 € x ±s表示 , 各组间比较用方差分析 , 组间两
性细胞出现在皮质区、海马区等区域 , 细胞种类有神
经元、大小胶质细胞。各时间点**组化阳性细胞数
见表 1。资料显示**组与模型组比较 , 在 12 h、1
d、3 d这三个时间点上 , 阳性细胞数目多少两者差异
无统计学意义 ( P > 0105) , 而在 7 d、14 d点 , 阳
性细胞数前者少于后者 ( t = 4133, P < 0105) ; 预防
组与模型组比较, 在 12 h、1 d、3 d这三个时间点
上 , 阳性细胞数前者少于后者 ( t = 14113, P <
0101) , 而在 7 d、14 d这二个时间点上 , 阳性细胞数
两者相比差异无统计学意义 ( P > 0105)。
2·4 β2 APPmRNA的原位杂交测试结果  观察 β2
APPmRNA的原位杂交测试后的切片 , 阳性表达细胞
的细胞浆呈深棕黄色 , 细胞种类有神经元、大小胶质
细胞 , 阳性细胞出现在皮质区、海马区等区域 , 各组
各时间点阳性细胞数目如表 1。**组与模型组比
较 , 在 12h、1 d、3 d这三个时间点上 , 阳性细胞数
目两者差异无统计学意义 ( P > 0105 ) , 而在 7 d、
14 d点 , **组的阳性表达数目明显少于模型组的阳
性表达数目 ( t = 4127, P < 0105) ; 预防组与模型组两比较用 q检验。
2  结果
2·1  各组大鼠被动回避反应行为测试结果  ⑴造模
后各组实验大鼠被动回避反应 “ 获得 ”能力的改变:
模型组不能学会被动逃避反应 , 而假手术组大鼠则能
学会被动逃避反应 , **与预防组的学习能力介于上
比较 , 在 12 h、1 d、3 d这三个时间点上 , 预防组的
阳性表达点明显少于模型组的阳性表达点 ( t
12138, P < 0101) , 而在 7 d、14 d这二个时间点上
两者阳性表达点数目差异无统计学意义 ( P
0105)。表 1 Aβ**组化、 β2 APPmRNA的原位杂交测试结果   ( € x ±s , n = 3)
  组别 Aβ
12h 1d 3d 7d 14d
β2 APPmRNA
12h 1d 3d 7d 14d
 A模型组 46 . 3 ±
6 . 1101
63 . 0 ±
6 . 2451
51 . 0 ±
4 . 5826
29 . 7 ±
2 . 5166
22 . 3 ±
3 . 5118
123 . 0 ±
6 . 5574
100 . 7 ±
7 . 6376
79 . 3 ±
9 . 0737
43 . 0 ±
6 . 5574
27 . 7 ±
2 . 5166
 B**组 43 . 7 ±
4 . 7258
57 . 3 ±
5 . 7573
47 . 7 ±
2 . 5166
22 . 0 ±
3 . 60553
10 . 7 ±
1 . 52753
117 . 0 ±
2 . 0000
91 . 3 ±
4 . 5092
71 . 7 ±
6 . 1101
29 . 3 ±
6 . 02273
10 . 7 ±
5 . 03323
 C预防组 31 . 7 ±
4 . 16333
45 . 0 ±
5 . 56783
33 . 3 ±
3 . 05513
27 . 0 ±
3 . 0000
20 . 3 ±
2 . 5166
86 . 3 ±
10 . 11623
54 . 7 ±
12 . 66283
43 . 7 ±
10 . 50393
35 . 7 ±
3 . 5512
24 . 7 ±
6 . 0277
 D假手术组 2 . 0 ±
3 . 46433 3
3 . 3 ±
3 . 05503 3
1 . 7 ±
1 . 52753 3
0 ±
03 3
0 ±
03 3
23 . 0 ±
13 . 45363 3
22 . 3 ±
6 . 11013 3
13 . 0 ±
3 . 60553 3
10 . 0 ±
2 . 64573 3
8 . 3 ±
1 . 52753 3
  空白组 0 ±
03 3
0 ±
03 3
7 . 3 ±
± 3 . 05513 3
6 . 7 ±
2 . 47213 3
  注:与同时间点模型组相比, t≥2158,
3
P < 0105, t≥4146,
3 3
P < 0101
3  讨论
阿尔茨海默病是一种原发变性型老年痴呆 ,其特
征特病理改变有:脑组织内出现大量老年斑 ( SP)、 神经
纤维缠结 (NFTS)、 神经元数量减少和颗粒空泡变性。
AD的发病机理十分复杂 ,可能是多因素相互作用的结
果 ,其中 Aβ异常表达是形成老年斑的关键因素 , tau蛋
白异常表达是形成 NFTS的关键因素。
异常 Aβ在持续性的大脑细胞损害中扮演了重要
AD中病理改变的影响。AR I等[ 9 ]
发现雌**无论在
Aβ作用之前、 还是作用之后 ,或同时给予 ,均可阻断
Aβ的神毒性作用。本实验研究结果表明紫河车对 AD
模型大鼠的干预对 AD模型大鼠脑组织中 Aβ增多与
沉积有减少作用 ,与预期相一致。紫河车干预后减少
AD模型动物脑组织内部 Aβ的沉积增多。Aβ的沉积
的主要原因之一是 APP 的增多 , 所以一般认为角色 ,其神经毒性与 AD关系主要表现在以下几方面:
打破钙平衡和产生氧自由由 ,能够增强谷氨酸毒性 ,诱
导一氧化氮的产生 ,导致大脑血管机能障碍 ,诱导神经
元凋亡 ,**神经系统的炎性反应。因此 Aβ在研究
AD的实验中常用作评价实验效果的重要指标之一[ 4 ]

He等[ 5 ]
用 OA注入大鼠的海马区 ,结果表明实验
大鼠出现行为学异常 ,其脑组织 NFTS形成、 老年斑出
现、 Aβ表达增加等合乎 AD的病理改变。用 OA注于
实验大鼠的杏仁核中 ,其设想是杏仁核属边缘系统部
分 ,而边缘系统与记忆和情绪都有极密切关系[ 6 ]
。本
实验结果显示 ,造模后实验大鼠行为学出现异常 ,如记
忆力衰退 ,认知能力减弱 ,静默少动等;化学检测其脑
组织显示有 Aβ及βAPPmRNA表达异常地增多;阳性
细胞在新皮层 ,海马区等等都有出现 ,并以神经元和胶
质细胞受损为主。
**方药对 AD模型动物脑内的 Aβ含量的影响
的研究是近几年来开展的 ,研究结果表明**方药确
有降低 AD模型动物脑内的 Aβ含量作用。赵长安
等[ 7 ]
研究表明:**填精方能抑制 AlCl 3 引起的血清
Aβ的升高 ,纠正逃避行为方式异常 ,提高大鼠的逃避
正确率 ,缩短逃避潜伏期 ,改善学习记忆能力。陈云波
察βAPPmRNA的变化可以与 Aβ的变化相互印证 ,免
疫组化也可以与原位杂交相互印证。本实验研究表
明 ,紫河车干预 AD模型大鼠后 ,β2 APPmRNA的过度
表达受到抑制 ,这表明了紫河车抑制 β2 APPmRNA表
达可能是其改善 AD病理改变的机制之一。
AD的临床表现为记忆力减退和认知功能减退 ,独
立生活能力降低等。中医认为 , AD一病 ,其病位在脑
与肾密切相关 ,脑为元神之府 ,主记忆、 智慧;中医理论
认为,肾是先天之本 ,精神之舍 ,主水济心 ,安志养神 ,
主骨生髓 ,充脑益智 ,肾病则髓空善忘 ,神乱意失。因
而肾精不足是 AD发病的主要病机。 《本草纲目 》 亦
云:“ 精与志皆肾经之所藏也 ,肾精不足,则志气衰 ,不
能上通于心 ,故迷惑善忘 ” 。杨柏灿等[ 10 ]
据脏腑及气
血阴阳定性把 139例 Alzhei mer型痴呆分为 6个证型 ,
涉及肾虚的比较达 91137%。说明从肾论治是** AD
的主要治法之一。林长兴等[ 11 ]
以调心方和**方治
疗 AD进行对照 ,发现调心方**有效率为 71111% ,
而**方则为 77114%。这充分说明中医药干预对 AD
模型动物的行为学改变的影响确有改善的作用。
本实验中用于干预 AD模型大鼠的紫可车是一味
**填精名药 ,有助阳补精 ,益血**功效 ,临床上用
βAPPmRNA的异常与 AD的形成也有密切的关系。观等[ 8 ]
研究表明**益智方对被 Aβ 25~35损伤的 NG
108~15细胞有保护作用。本实验用于干预 AD模型
大鼠的紫河车为**填精名药 ,从临床实践看 ,能减轻
AD病的症状。紫河车中某些成分如雌**等可能对
于肾气不足 ,精血衰少所致诸证。如《日用本草 》 说紫
河车“ 主虚损劳极 ,癫痫 ,失志恍惚 ,安心养血、 **补
肾 ” 。章生银[ 12 ]
用小鼠跳台法观察紫河车水煎液对由
东莨菪碱及亚硝酸钠所致的小鼠记忆损伤过程的影响,

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