神经系统染色技术

神经系统染色技术

   神经病理学是组织病理学的一个重要组成部分，神经病理学技术是一门较特殊的病理技术。神经组织的结构和功能较为复杂的特殊，用常规方法处理，常得不到想要的东西，因此，要想获取想要的东西，必须靠特殊的处理方法，才能将其充分地显示出来。神经系统方面可显示的物质较多，如尼氏小体、髓鞘、变性髓鞘、神经纤维和神经胶质细胞等等。这些都要靠特殊的银浸染技术，才能显示出来。下面将介绍几种显示上述物质的方法。
应用：神经系统染色应用于神经系统方面的各种**，如创伤、中毒、感染等引起神经系统方面的**，应作正常髓鞘和变性髓鞘的染色，以观察髓鞘的变化及脱失情况，如脱髓鞘假瘤与弥漫的纤维星型细胞瘤镜下有非典型性核分裂象和弥漫浸润的单核细胞，充分发育的巨噬细胞缺少细胞将会误诊为胶质瘤，应作胶质细胞和神经纤维染色。
（一）苏木素VG法染**神经
1、切片脱蜡至70%酒精
2、Weigert氏铁苏木素染10分钟
3、自来水稍洗
4、如有必要，用1%盐酸酒精分化
5、流水洗10-15分钟
6、VG液染30分钟
7、蒸馏水快洗
8、95%酒精分化
9、脱水、透明、封固
结果：细胞：灰黑色
          髓鞘：灰白色
          胶原：红色
          肌纤维：黄色
          神经细胞细胞浆       黄色/琥珀色
          胶质纤维                       琥珀色
（二）神经细胞尼氏体染色
正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏化，它们主要分布于神经细胞的浆中，形状有大有小，如三角形，有的为椭圆形。这些物质能被大部分的蓝色染料所染色，这些染料如焦油坚牢紫（Cresylfast violet）亚甲蓝（methylene blue）甲苯胺蓝（toluidineblue）硫董（thionin）等钭其染为蓝色。但是，当神经细胞受伤后，胞质内的尼氏体更可发生变化，严重的可消失。
焦油坚牢紫显示尼氏体
焦油坚牢紫          1g
蒸馏水                       100ml
操作方法：
1、切片脱蜡至水
2、用焦油坚牢紫水溶液浸染20-30分钟
3、水洗
4、用95%酒精分化
5、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶
结果：神经细胞单位：紫-蓝色
          细胞核：紫-蓝色
          尼氏体：紫-深蓝色
注意：1、应用酒精分化切片，要迅速，防止过度分化，将切片上的颜色全部脱掉。
神经纤维染色
（三）改良的Marsland, Glees方法
（I）试剂的配制：
取无水乙醇  10ml，加入20%的硝酸银水溶液，搅拌均匀后逐滴加入浓氨水，先是形成沉淀，后再逐滴加入氨水，让早期形成的沉淀彻底溶解，然后再加入另外2-3滴氨水，即可使用。平时保存于4℃冰箱中。
（II）操作方法
1、切片捞于硅化载玻片上，于60℃烘烤2小时后备用。
2、切片脱蜡至水。
3、0.5%高猛酸钾处理切片5分钟。
4、水洗。
5、2%草酸处理切片2分钟。
6、自来水洗，蒸馏水洗。
7、20%硝酸银于37℃中作用60分钟。
8、直接入10%福尔马林溶液中处理，直至切片颜色转为黄色到棕色为止，约10-20秒。
9、直接入上述氨银液处理30秒。
10、直接入10%福尔马林处理1-2分钟。
11、自来水洗。
12、5%硫代硫酸钠固定切片5分钟。
13、脱水、透明、封固。
结果：
神经纤维：深棕色至黑色，背景淡棕色。
注意事项：
1、整个过程，应仔细操作，防止污染造成背景染色。
2、切片在9步骤后于镜下检查，如果浸染程度不够，颜色较浅，可以重复8、9步。
（四）改良的Palmgren氏法染神经纤维
（I）试剂的配制：
a、酸性福尔马林
   40%甲醛                 25ml
   蒸馏水                    75ml
   1%硝酸                  0.2ml
b、银溶液
      销酸银                 15g
       硝酸钾（Potassiumnitrate）       10g
      蒸馏水                10ml
       5%醋酸氨（amino acetic acid） 1ml
c、还原液
       焦 酚（Pyrogallol）        10g
      蒸馏水                450ml
      无水乙醇             550ml
      1%硝酸               2ml
       用前须静置24小时
d、调色液
      氯化金                1g
      蒸馏水                200ml
      无水乙醇             550ml
      1%硝酸               2ml
e、加强剂
      50%乙醇                    100ml
      苯胺油（anilineoil）    2滴
f、固定液
       5%硫代硫酸钠
（II）操作步骤
1、应用硅化载片裱片，于60℃烘烤切2小时。
2、切片脱蜡至水。
3、0.5%-1%高猛酸钾水溶液处理切片5分钟。
4、自来水洗。
5、2%草酸水溶液处理切片2分钟。
6、自来水洗。
7、用酸性福尔马林5-10处理分钟。
8、蒸馏水洗换3次，每次2分钟。
9、用银液处理10分钟（于37℃）
10、用预热至45℃的还原液，摔去还原液，加入新的还原液，如此反复数次，至镜下结果满意为止。
11、50%乙醇苯胺油轻洗10秒钟。
12、蒸馏水洗3次。
13、用氯水金调色。
14、自来水洗。
15、5%硫代硫酸钠处理切片5分钟。
16、脱水、透明、封固。
结果：神经纤维棕色至黑色。
（五）改良的Eager’s 法染变性轴索
（I）试剂的配制
a、氨银液
1.5%硝酸银         40ml
95%                    24ml
浓氨水                4ml
2.5%氢氧化钠      3.6ml
b、还原液
无水乙醇             9ml
蒸馏水                81ml
1%柠檬酸            2.7ml
10%福尔马林             2.7ml
（II）操作方法
1、组织用福尔马林盐固定
2、自来水洗，浸入蒸馏水中。
3、恒冷切片附贴于硅化的载玻片上或切片收集于水杯内。
4、切片或用玻璃钩将切片移入2.5%硝酸双氧铀（uranyl nitrate）处理5分钟。
5、蒸馏水轻洗后置入氨银液中，直到切片变棕黄色为止，约10-15分钟。
6、直接进入还原液至颜色没有其它变化为止。约2-5分钟。
7、蒸馏水洗。
8、5%硫代硫酸钠处理切片5分钟。
9、水洗，将切片裱于载片上。
10、脱水、透明、封固。
结果：变性神经纤维，棕色到黑色。
          正常的神经纤维，灰黄色。
（六）改良的Loyez氏法染神经髓鞘
（I）试剂的配制
a、碳酸锂苏木素液
碳酸锂（Lithiumcarbonate）            1ml
饱和水溶液
10%成熟苏木素无水乙醇液                    5ml
蒸馏水                                                   44ml
b、铬酸氧化液
重铬酸钾                                         10g
浓浓酸                                     10ml
蒸馏水                                     90ml
c、Loyez氏分化液
四硼酸钠                           1g
铁***                           1.25g
蒸馏水                                     100ml
（II）操作方法
1、切片脱蜡至水
2、入以b液为原液酸成10%的氧化液氧化切片24小时。
3、水洗。
4、入4%的铁明矾水溶液中媒染24小时。
5、蒸馏水洗。
6、入碳酸锂苏木素染液中浸染12-24小时。
7、自来水洗。
8、4%铁明矾水溶液分化，至髓鞘显示清晰为止。
9、自来水洗。
10、Loyez氏分化液分化切片约2分钟。
11、水洗。
12、常规脱水、透明并封固。
结果：髓鞘及红细胞显示深蓝色，轴索呈淡白色至淡黄色，其它组织也呈现淡黄色或灰黄色。
（III）注意事项
1、在常规活检中，组织固定都是以福尔马林为主，没有特殊的固定液，如果作为科研标本，则可预先准备好特殊固定液固定组织，这样效果会更好。
2、原法采用Laanna氏铬化液即重铬酸钾9.5g，氯化锌4.5g，蒸馏水100ml，未氧化切片，改良法采用5%铬酸氧化液氧化切片，氧化力更强，效果更好。载片须用硅化载片，否则切片容易脱落。