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砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响（高架十字迷宫应用）
日期：2024-05-01 15:12
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摘要：
南台科技大学
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
摘要
根据世界卫生组织(World Health Organization; WHO)统计发现，目前全世界约有百分之三的人口罹患忧郁症(depression)，而各种**所引起的负荷或失能中，精神**是*重要的因素，在公元1999年精神**已高达各种**或伤害所造成失能生命人年(Disability Adjusted Life Years, DALYs)的百分之十一点五，且预估到了公元2020年，将上升至百分之十五，其中又以忧郁症占百分之三十六点五*多，因此世界卫生组织将忧郁症、癌症以及艾滋病并列为二十一世纪的三大**及卫教预防重点工作。
砷是存在于自然界地表土壤及地下水中的元素。人类暴露砷化合物的途径主要来自于职业暴露的工人以及来自于环境的暴露。过量的砷化合物暴露会造成的健康效应有许多方面，包括癌症（如皮肤癌、膀胱癌、肝癌及肾脏癌等）、皮肤**、神经**、血管**（包括周边血管，心血管**等）。三氧化二砷所引发的毒性为氧化压力的产生，也包括反应性氧族的形成、脂质过氧化的增加，台湾西南沿海地区地下井水的砷含量很高，根据文献有超过50万人口曾暴露在此环境中而出现一独特的周边血管**—乌脚病。在先前的研究指出乌脚病流行区的心血管**的死亡率及盛行率均有增高的现象，相关研究亦指出累积砷暴露量与缺血性心脏病、高血压等**有关，但与忧郁症相关之研究极少。
本研究为探讨砷暴露对忧郁症动物模式之影响，砷暴露容易导致动脉硬化使胰岛素耐受性异常，形成的高胰岛素血症亦可引起脂质代谢异常，本研究利用动物实验长期喂食三氧化二砷，并观察相关生化值，如血中胰岛素浓度、三酸甘油酯(TG)、总胆固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量变化，并在牺牲小鼠后，取肝脏、脑部、肾脏以及脂肪藉由高效液相层析仪定量出5-HT及单胺类神经传导物质表现量，并透过肾脏、肝脏及脑部的组织切片方式，观察其结构的完整和细胞的丛集情形，探讨胰岛素阻抗导致忧郁症之相关机制。关键词：砷、胰岛素耐受性、忧郁症、5-HT
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
**章研究动机与目的
砷（arsenic）是地壳（earth crust）的组成分之一，原子序33，分子量74.92，含量占所有元素的**十位，外观看来成灰色，易碎，成结晶状，在空气中易失去光泽。常与氧、氯及硫形成无机化合物，广泛存于空气，水及土壤中，也会与碳或氢形成有机砷化物，常见于植物或摄食无机砷化物的微生物内。一般而言，无机砷毒性高于有机砷，除了广泛存于自然界外，砷也普遍应用于工业、制造业、木材加工、农业、半导体制造及医药上，成为常见的环境污染物；人类可经由饮用或摄取含砷井水、农产品、医疗行为或工商业行为所造成的砷污染物，而受到砷暴露所带来的伤害。砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
有关慢性砷暴露引起中毒的研究，可以分成两大部分：**部分分为职业性暴露，包括采矿业、冶炼业及农药使用者，**部分则为环境暴露，主要为饮水暴露。砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
当人体受到急性砷暴露中毒时，会引起腹泻、呕吐及肝和肾脏毒性。如接触至Arsine(AsH3)气体可引起溶血，严重时会产生急性肾管状细胞坏死，*后导致肾衰竭。然受到慢性砷暴露中毒的症状较不明显，一般发生症状如普通感冒，有体弱、**、昏睡等症状发生。长期暴露时，则皮肤上会有黑色素沈积、发生皮肤炎、角质化、脱毛等病变出现。一些研究指出慢性砷中毒可导致肾脏病变及骨髓受损。长期受到砷暴露，严重会导致癌症，如肺癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌、肾癌等，及心血管、末梢血管病变发生。
在台湾，近年来半导体产业，成为当今*闪亮的明星产业。这两年，光电半导体产业也急速地崛起加入生产行列，显示这一波电子产业发展脉动仍持续蓬勃发展中，然这两种产业于制程中均会使用砷元素与砷化合物作为原料，对于作业中之人员受到砷暴露的危害，也就令人需特别关心了。先前研究指出，于晶圆厂中从事离子植入机台维修保养作业工程人员，在打开机台进行维修保养时，可能会遭受到砷暴露的危害，因此该维修保养的过程，是项潜在危害的作业。该研究亦指出人员的尿液中之总无机砷代谢产物浓度随着工作后的时间而有上升的趋势。经检测从事离子植入机之维修工程师于维修后之尿中总砷代谢产物浓度为12.8~46.8μg/L(以肌酸酐浓度校正后之尿中总无机砷代谢物浓度为3.6~67.2μg/g creatinine)，证明维修保养工程人员有受到相当砷含量的暴露。
来自于环境的无机砷暴露则主要来自于饮水，由于砷是存在于地表自然界的元素，其天然形成的无机砷就很容易污染了地表的水源，包括井水。人类为了取得较干净的饮水以免罹患肠胃道**就会挖井以取得较「干净」的饮水。如果居民饮用井水遭到砷的污染，就有慢性砷暴露而中毒的机会。这种因饮水而造成慢性砷中毒的现象在台湾、孟加拉国、智利、匈牙利及日本等国家均出现过。在众多死亡率的研究中，慢性饮水砷中毒在肺癌、肾脏癌、膀胱癌或泌尿系统癌症的标准化死亡比率，在智利、日本、台湾及孟加拉国)的研究中均有较高的趋势，而皮肤癌在智利、台湾、孟加拉国的研究中有较高的现象。另外，蔡氏等)在台湾乌脚病流行区的研究中更发现除了上述癌症之外，该地区民众尚有许多癌症均存在有较高的标准化死亡比率，如肝癌、喉癌、胃癌、大肠癌及**癌等。以上这些研究均是针对饮水高砷暴露（>50μg/l）的研究。而在较低砷暴露浓度的研究中，Buchet等人发现在每天吸收无机砷>35μg/day即会增加肺癌死亡率，陈氏等人的研究也显示即使每天使用符合50μg/l的饮水标准仍会有出现罹患癌症的风险。慢性砷暴露造**体*重要的健康效应在于其会造**体癌症的产生在职业暴露方面，作业劳工会有的砷暴露，主要来自于冶炼业过程中吸入所产生的含砷蒸汽而产生肺癌。而一般大众的砷暴露则来自于环境暴露，尤其是来自于饮水中无机砷的暴露。居民长期饮用含无机砷的水源在众多流行病学调查中显示会造成多种癌症的发生包括皮肤癌、肺癌、膀胱癌、肾脏癌、肝癌以及**癌，而且有些具有剂量效应关系。
由以上众多流行病学的研究显示砷暴露会引发皮肤癌，肺癌，膀胱癌，肾脏癌，肝癌以及**癌的发生IARC在1987年即已将砷列为group 1A即人类确定致癌物。砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
在脑中风和有关砷中毒方面的研究，根据两篇分别在台湾乌脚病流行区及宜兰地区以问卷方式所进行的探讨脑中风病人与含砷饮用水暴露量之关系的研究结果显示，在宜兰地区长期使用含砷井水的居民具有较高的脑中风盛行率，而在乌脚病流行区之居民脑中风死亡率的研究中显示并无增加的现象，但该地区的脑中风同样有较高的盛行率。在心血管**的研究方面，该地区居民长期的井水砷暴露，无论在心血管**的盛行率及死亡率均有增加的现象，并且无机砷暴露和颈动脉内膜中腔间的肥厚度(intima-media thickness, IMT)具有良好的相关性存在着剂量效应关系。由此可知无机砷中毒和脂质代谢异常具有显著的相关性。
近年来，许多研究也提出，脂肪酸组成的异常可能是引起忧郁症的原因之一，脂肪酸可与甘油以及其它成分如：胆碱(choline)、肌醇(inositol)等物质结合构成磷脂质，储存于组织中。磷脂质是脑部所有细胞膜结构的主要组成份，当细胞膜磷脂质组成改变，可能会造成细胞膜微黏滞性或神经传导系统的改变，如血清素及(nor)adrenaline，此两种物质已被认为与忧郁症的精神病理机制有关。另外，Fehily等人、Ellis 及Sanders也发现，忧郁症患者血浆磷脂质组成与正常组比较有显著差异。由此推测，磷脂质脂肪酸组成改变在忧郁症的精神病理学扮演重要角色。
脂肪异常，包括三酸甘油脂与LDL-C的偏高，以及HDL-C的偏低。在流行病学的调查研究中可以发现，在对没有糖尿病的健康族群所进行的横断研究中，胰岛素浓度与肥胖的确和脂肪代谢异常有关；也有研究发现，三酸甘油脂过高的患者体内，游离脂肪酸与胰岛素浓度都会比三酸甘油脂正常者来的高。而在追踪性研究中，肥胖与胰岛素对于后来的脂肪异常的发生具有预测力。此外，基线胰岛素预测八年后三酸甘油脂的上升与HDL-C 的下降，以及体重减轻可以改善三酸甘油脂过高和HDL-C过低状况，都证明体内胰岛素上升与肥胖对血脂异常所会造成的影响。
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
游离脂肪酸影响细胞的胰岛素敏感性的机制可能有二。一是游离脂肪酸和葡萄糖对于细胞而言都是能量分子，皆可转化成乙酰辅脢甲(acetyl CoA)再进一步转换出能量，因此二者间存在着竞争关系。当体内充满大量的游离脂肪酸与葡萄糖时，由于葡萄糖代谢的糖解反应(glycolysis)会因为细胞内的acetyl CoA或中间产物—柠檬酸(citrate) — 的增加而受到负回馈，因此*后细胞所利用的acetyl CoA主要来自游离脂肪酸，进而影响到葡萄糖的正常代谢；前述肝细胞会因游离脂肪酸而增加糖质新生，亦是因为糖解反应受到抑制所致。除此之外，在正常状态下，肌肉与脂肪组织会受胰岛素的调控而增加细胞膜上的葡萄糖运输蛋白(glucose transporter 4)；但当游离脂肪酸升高，一方面可能会影响该蛋白的基因表现，另一方面降低胰岛素受器后的讯号传递，因此会降低糖类代谢率，造成胰岛素抗性的现象。
理论上，在胰岛素抗性的状态下，在脂肪组织进行脂肪分解以及外围组织无法有效地代谢脂肪酸之下，肝脏增加其对游离脂肪酸的吸收，进而当肝脏将游离脂肪酸转化为三酸甘油脂之后，以VLDL-triglyceride再送到血流中，因此VLDL-triglyceride量升高，此时VLDL上的apoC-III蛋白亦会增加。外围脂蛋白脂肪酵素(lipoprotein lipase)的活性会受到apo C-III蛋白的干扰而降低，同时apo C-III蛋白亦会干扰肝脏对VLDL的回收，使得来自肝脏的VLDL-triglyceride 在无法被有效利用或移除而逐渐于血液中累积。又因为VLDL12 triglyceride的浓度上升，因此VLDL-triglyceride 和LDL/HDL之间藉由胆固醇脂转移蛋白(cholesterol easter transferprotein)所进行的三酸甘油脂与胆固醇交换反应会增加，导致HDL-C所携带的胆固醇下降。加上胰岛素抗性状态下，肝脏脂肪脢的活性加强，加速肝脏对HDL-C的移除。砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
血清素(Serotonin, 5-Hydroxytryptamine,5-HT)于1948年Rapport等人由血液**分离出来，并之后证实存在于**神经系统。血清素广泛存在于自然界动植物中，包括脊椎动物、水果、坚果类及毒蛇的毒液，血清素可以自然型态存在，并且有刺激**神经及周围神经系统之活性。血清素除了可以从一般饮食中摄取，人体体内也能藉摄取饮食用色胺酸 (dietary tryptophan)从肠胃道吸收，然后和大型中性胺基酸 (large neutral amino acids (LNAAs): tyrosine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine)竞争进入**神经系统的途径，进入后经由色胺酸氢化脢(tryptophan hydroxylase) 形成5-氢化色胺酸 (5-hydroxy- tryptophan)，再经由芳香族胺基酸去碳酵素 (AAAD: aromatic amino acid decarboxylase)而产生内生性血清素。血清素在体内会被单胺氧化酶(monoamine oxidase)和醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)很快代谢为5-hydroxy-indoleacetic acid (5-HIAA).
血清素是一种神经细胞之间相互通信的化学传导物质，目前认为它与许多病症的病因及**有关，尤其是关于**神经系统，像控制疼痛、抑制食欲、焦虑感、惊恐感、兴奋感、及睡眠习惯等情绪和记忆与学习等行为、体温调节、心血管功能、肌肉收缩、*****调节等。在神经系统中，以serotonin作为神经传递物的神经元，主要调控的生理功能和运动活性、睡眠-觉醒-警觉回路(sleep-awake-alert circuit)、感觉神经讯息传入、进食等动物行为相关。且serotonin神经元对其他神经元活性的调控是有稳定的作用。
长期服用抗忧郁剂会降低血清素和正肾上腺素接受体的功能与表现，但会活化环状磷酸腺苷（cyclicAMP）讯息传导路径，包括：增加PKA和转录因子CREB（cAMP response element-bindingprotein）的浓度。单胺接受体活化后导致Ca2+激酶浓度增加也可调节CREB的表现。活化cAMP讯息传导路径意味着血清素和正肾上腺素正向调节（up-regulated）了一些大脑功能。*近的研究发现脑内神经滋养因子BDNF（CREB 转录因子的目标物）也会在长期服用抗忧郁剂后表现量增加。研究证实长期给予抗忧郁剂会活化cAMP 讯息传导路径，进而增加了大脑海马结构的BDNF mRNA 表现量。BDNF与神经的分化、生长及维持大脑成熟神经细胞的存活有关。有相关研究指出BDNF与忧郁症的关连性：临床大脑影像研究发现忧郁症病人的海马结构萎缩且BDNF mRNA表现量下降。综论上述研究显示了BDNF也许与忧郁症的病理成因有着显著的关连性。
本研究为利用高胆固醇饲料以及三氧化二砷诱导C57BL/6小鼠动脉硬化模式，监测相关生化值，如血中胰岛素浓度、三酸甘油酯(TG)、总胆固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量变化，引发胰岛素阻抗性造成脂质代谢异常，并利用十字形迷宫(EPM)测定观察小鼠是否有忧郁症行为产生，以探讨砷暴露所造成脂动脉硬化以及胰岛素耐受性异常对忧郁症之影响，并再牺牲小鼠后，取肝脏、脑部、肾脏以及脂肪定量出5-HT以及单胺类神经传导物质表现量。在组织病理检查方面，透过肾脏、肝脏及脑部的组织切片方式，观察其结构的完整和细胞的丛集情形，以探讨在长期砷暴露下诱发之胰岛素阻抗影响忧郁症动物模式之分子机制。
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
**章实验材料与方法
**节、实验动物与材料
实验材料
2 %高胆固醇饲料、鼠科正常饲料(Basal diet, Product Code5755)、含EDTA采血管、三氧化二砷（As2O3）、胰岛素（Insulin）、乙醇（Ethanol）、封片胶、血糖仪、血糖试纸片、注射针头。
实验动物来源
本实验所使用的C57BL/6品系的小鼠由国家实验动物中心购得，并饲养于奇美医院实验动物中心。小鼠分别饲养于不锈钢笼中，自由取食及饮水。动物房温度维持在21 ±2 ℃，相对湿度50-70 %，以自动定时器控制光照周期，08:00~20:00为光照期(light period)，20:00~08:00为黑暗期(dark period)。
**节、实验动物模式设计
实验动物模式设计如下：
实验动物进入动物中心后先以正常饲料(Basal diet, Product Code 5755) 喂食二周，并随机分为4组，每组10 只，分别进行蛇根碱(reserpine)诱导忧郁症模式，以2mg/kg的剂量连续腹腔注射5天后，再依下列组别：
【1】 6周雄性C57BL/6品系小鼠－给予正常饲料并任其自由取食及饮水，共喂食20周。
【2】 6周雄性C57BL/6品系小鼠+砷－给予正常饲料8周后，于饮用水添加砷(133g/ml)喂食12周，共20周
【3】 6周雄性C57BL/6品系小鼠+2 %高胆固醇饲料－给予内含2%高胆固醇之饲料，给予正常饮水及任其自由取食及饮水，共喂食20周。
【4】 6周雄性C57BL/6品系小鼠+ 2 %高胆固醇饲料+砷－给予2 %高胆固醇饲料8周后，并于饮水中添加砷（133g/ml）喂食12周，共喂食20周。
实验期间依照各实验测量需求时间点采取样品进行相关分析：
每周测量及纪录小鼠的体重，实验期间依照各实验测量需求时间点采取血液进行相关生化值分析及血清蛋白质分析，并于各设计时间点牺牲小鼠，取下大脑、小脑、肝脏、肾脏进行IHC染色、组织砷含量分析、血清三酸甘油脂等生化值分析、胰岛素耐受性测试。
实验设计及测试样品采集时间点
品 系 | 只数 | 组 别 | 实验 |
C57BL/6 正常饲料 | 10 | 喂食正常饲料20周 | §每两周 -体重 -胰岛素耐受性 -血清生化值分析(TG,TC,HDL,LDL) -血中蛋白质分析 -十字形迷宫(EPM) |
10 | 喂食正常饲料8周后，在饮用水中添加砷12周(133g/ml) | ||
C57BL/6 2 %高胆固醇饲料 | 10 | 喂食2 %高胆固醇饲料20周 | |
10 | 喂食2%高胆固醇饲料8周后，在饮用水中添加砷12周(133g/ml) |
第三节、血液生化值测试
将上述四组实验动物，采血进行相关生化值检测。使用采血管收及小鼠眼窝血液，以拇指及食指拉住眼睛后面皮肤，让眼球凸出，微离心管从内侧眼角进入，经过结膜到眼球后方，轻轻转动管子，血液会延管子流出，确认有血液流出后再以采血管承接，采得血液后对眼皮稍加压力可止血。采取约0.5ml全血，经5000rpm 10分钟离心后，取0.2ml血清以进行生化值实验，血液生化值 (总胆固醇TC、三酸甘油脂TG、高密度脂蛋白HDL和低密度脂蛋白LDL) 是由Hitachimodel 7600 automatic analyzer以比色法原理测得。
第四节、胰岛素耐受性测试（ITT）
依设计时间点将上述五组实验动物，测量胰岛素耐受性，于实验进行前禁食8小时，接着腹腔注射胰岛素0.5U/Kg。使用血糖仪MAJOR II在腹腔注射胰岛素前以尾部取血测量一次血糖，注射胰岛素后15、45、95、135、180分钟测量一次血糖，分别记录后绘图观察曲线变化。
砷长期暴露下对胰岛素耐受性依赖型忧郁症动物**模式之影响暨相关分子机制探讨（高架十字迷宫应用）
第五节、**动物模式建立_忧郁症的诱发
举臂式十字形迷宫(Elevated plus maze test)
高架十字迷宫是一种常用来检测动物忧郁及焦虑的行为测验工具，此迷宫离地50cm高，路径状似中文的「十」字，四边分别由相对的开放端及封闭端所构成，可用来观察动物进入开放端和封闭端的次数及时间、停留在正中开放空间的时间、动物头部下探行为及动物的活动。
此仪器由两个开放臂(30 ×5 cm)及两个封闭臂(30×5 ×15 cm)，中以开放之正方形(5 ×5 cm) 相连接，距离地面50 cm高所组成。将小鼠放入正方形处，面向开放臂，在完全黑暗连续测定5 分钟。并评估进入开放臂及封闭臂时间与进入开放臂及封闭臂次数。
评估指数 | 焦虑 | 抗焦虑 |
进入开放臂时间和次数 | ↓ | ↑ |
进入封闭臂时间和次数 | ↑ | ↓ |
第六节、数据处理与分析
本实验数据处理及绘图使用sigmaPlot软件，实验结果表示方法均为mean±SE，各组间显著差异（p <0.05）则是使用sigmaPlot软件中T-test计算。
第三章结果
图一. 体重变化
图一.体重变化
图二. 十字迷宫(开放臂时间)
图二.十字迷宫(开放臂时间)
图三.十字迷宫(封闭臂时间)
图四. 口服葡萄糖耐受性试验
图五. 口服葡萄糖耐受性试验
图六. 胰岛素耐受性试验
图六
图七. 总胆固醇量(total cholesterol)
图八. 三酸甘油脂(triglyceride)
图八
图九.高密度脂蛋白/低密度脂蛋白
分别为六组
**组正常对照组(喂食一般饲料)、**组喂食砷(As)、第三组喂食蛇根碱(reserpine)、第四组喂食蛇根碱(reserpine)与高胆固醇饲料(HFD)、第五组喂食蛇根碱(reserpine)与砷(As)、第六组喂食蛇根碱(reserpine)与高胆固醇饲料(HFD)+砷(As)
第四章结论
砷是存在于自然界地表土壤及地下水中的元素。来自于环境的无机砷暴露则主要来自于饮水，由于砷是存在于地表自然界的元素，其天然形成的无机砷就很容易污染了地表的水源,人类暴露砷化合物的途径主要来自于职业暴露的工人以及来自于环境的暴露。过量的砷化合物暴露会造成的健康方面有许多影响,砷暴露容易导致动脉硬化使胰岛素耐受性异常，形成的高胰岛素血症亦可引起脂质代谢异常,当人体受到急性砷暴露中毒时，会引起腹泻、呕吐及肝和肾脏毒性。如接触至Arsine(AsH3)气体可引起溶血，严重时会产生急性肾管状细胞坏死，*后导致肾衰竭。
本实验为探讨砷暴露对忧郁症动物模式之影响，砷暴露容易导致动脉硬化使胰岛素耐受性异常，形成的高胰岛素血症亦可引起脂质代谢异常，本研究利用动物实验长期喂食三氧化二砷，并观察相关生化值，如血中胰岛素浓度、三酸甘油酯(TG)、总胆固醇(Cholesterol)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)在血液中的含量变化，并在牺牲小鼠后，取肝脏、脑部、肾脏以及脂肪藉由高效液相层析仪定量出5-HT及单胺类神经传导物质表现量，并透过肾脏、肝脏及脑部的组织切片方式，观察其结构的完整和细胞的丛集情形，探讨胰岛素阻抗导致忧郁症之相关机制。
